MM_FS_CNJ_0153 出口食品小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法

MM_FS_CNJ_0153出口食品 小肠结肠炎 耶尔森氏菌 微生物法

MM_FS_CNJ_0153

     出口食品小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法

1.适用范围

    本方法适用于出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁中耶氏菌检验，其他食品可参照使用。

2.培养基

2.1.改良的磷酸盐缓冲液

    将前三种成分溶于水中，再加入后两种成分，溶解后调至pH7.6，分装于500mL广口玻璃瓶内，每瓶225mL，高压灭菌121℃15min。

2.2.改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤(modified yeast extract-rose bengal broth)

2.2.1.基础液

    将上述各成分溶于蒸馏水中，加热使之完全溶解，调至pH8.0，121℃高压灭菌15min。

2.2.2. 40g/L山梨糖水溶液：100.00mL。

2.2.3. 10g/L丙酮酸钠水溶液：100.00mL。

2.2.4. 4g/L孟加拉红水溶液：10.00mL。

    2.2.2，2.2.3溶液流通蒸汽加热0.5h灭菌，2.2.4溶液过滤除菌，将灭菌过的此三种溶液加到灭菌、冷却的基础液中，调至最终pH为8.0，以无菌操作分装于18mm×180mm灭菌的试管中，每管8mL，4℃冰箱保存备用。

2.3.含吐温80的麦康凯琼脂

    将琼脂于800mL蒸馏水中加热溶化，以50mL蒸馏水将吐温80稀释，再将其他各成分(指示剂除外)加入150mL蒸馏水中，加热使之完全溶解。将后二种溶液加至已溶化的琼脂液中，充分混匀，调至pH7.1±0.2，再加入指示剂，混匀后121℃高压灭菌15min，待冷至50～55℃时，立即倾注于灭菌平皿内，每皿约15mL，制成的琼脂平板呈淡橙色。

2.4.含吐温80的亚硫酸铋琼脂

2.4.1.基础液

2.4.2.亚硫酸铋混合液

2.4.2.1.溶解200g无水亚硫酸钠于1000mL蒸馏水中，配成200g/L水溶液。

2.4.2.2.溶解50g枸橼酸铋铵于500mL蒸馏水中，配成100g/L水溶液，加1mL浓的氢氧化铵，放置至澄清，可能还需再加数毫升氢氧化铵。加此溶液于2.4.2.1溶液中并混合之。

2.4.2.3.加100g无水磷酸氢二钠并混合之。

2.4.2.4.加10g枸橼酸铁铵于100mL蒸馏水中，配成100g/L水溶液。并将此液加入上述的2.4.2.1、2.4.2.2、2.4.2.3的混合液中。

    将混合液于100℃加热2min或3min，用橡皮塞塞瓶，储存于室温暗处，不可放于冰箱内。

2.4.3.加70mL亚硫酸铋混合液于1000mL经121℃灭菌15min并冷至70℃左右的基础液中，彻底摇匀，再加4mL10g/L煌渌水溶液，混匀，待冷至50℃左右时倾注平皿。制成的平板应为淡乳黄色、不透明，存放于室温暗处或冰箱内，以临用前一天制备为宜。

2.5.改良的克氏双糖铁琼脂

    以800mL蒸馏水将琼脂加热溶化，再用200mL蒸馏水将其他成分(酚红除外)加热溶解，再将以上两种溶液混匀，调至pH7.4±0.2，然后加入酚红，分装于13mm×130mm试管，121℃高压灭菌15min，待冷至50℃左右，斜置成深高层斜面。制成的培养基为淡橙红色。

    培养基采用高层穿刺、斜面密布划线接种法。25℃培养24±2h。观察结果：小肠结肠炎耶尔森氏菌的反应为底层斜面均产酸、变黄色、无硫化氢、不产气(偶有少量小气泡)。

2.6 rustigian氏尿素酶试验培养基(改良法)

2.6.1.基础成分

2.6.2.浓尿素液

2.6.3.将上述两液混合，分装于10mm×100mm的灭菌试管中，每管约1mL左右。制成的培养基为淡橙黄色，尿素酶反应阳性者培养基由淡橙黄色变为桃红色，阴性者颜色不变。

2.7.鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验培养基

2.7.1.基础液

2.7.2.基础液分成三等分，第一部分不加任何氨基酸，分装试管作对照用；第二部分按10g/L加入L-赖氨酸双盐酸盐；第三部分按10g/L加入L-鸟氨酸双盐酸盐。若使用DL氨基酸，应相应地于培养基中按2%浓度加入。加入氨基酸后应再调pH，然后分别分装于10mm×100mm试管中，121℃高压灭菌10min。

2.7.3.培养基接种后，应加一层液体石蜡(约10mm厚)，于25℃培养24～30h。阳性反应者为紫色或红紫色，弱阳性者为青灰色，阴性反应为黄色。

2.8.糖发酵培养基

2.8.1.糖发酵肉汤基础液

2.8.2.蔗糖、山梨醇最终使用浓度为10g/L，可于灭菌前加入基础液中，分装试管，121℃高压灭菌10min。L-阿拉伯糖和鼠李糖最终使用浓度为10g/L，应先配成100g/L水溶液，L-阿拉伯糖水溶液流通蒸汽灭菌30min，鼠李糖水溶液121℃高压灭菌10min，然后分别以无菌操作加入先经121℃高压灭菌15min的基础液中，无菌操作分装于已灭菌的13mm×130mm试管中，每管3mL。

2.8.3.Andrade氏指示剂

    将酸性复红溶于蒸馏水中，并加入氢氧化钠，数小时后，如复红褪色不够，再加1mL或2mL氢氧化钠溶液，此试剂如保存时间较长则效果更好。

2.8.4.此培养基制成后近于无色，接种后于25℃培养24±2h，阴性反应应继续培养观察4d。阳性反应为红色，阴性反应则颜色不变。

2.9.西蒙氏枸橼酸盐琼脂

    加1∶500溴麝香草酚蓝指示剂溶液40mL，混匀，分装13mm×130mm试管，每管约4mL。121℃高压灭菌15min。斜置试管使成2.5cm高层和4cm长的斜面。

    制成的培养基为透明、草绿色，接种后于25℃培养24±2h，阴性反应者观察4d。阳性反应者斜面变为蓝色，阴性反应则颜色不变。

2.10.5g/L氢氧化钾溶液

2.10.1.标准溶液

    称取40g氢氧化钾，溶于经121℃高压灭菌30min的5g/L氯化钠溶液中，使成400g/L氢氧化钾标准溶液，于4℃保存备用。

2.10.2.取1mL400g/L氢氧化钾标准溶液，加入经121℃高压灭菌30min的79mL 5g/L氯化钠水溶液中，分装于已灭菌的18mm×180mm试管中，每管9mL，此溶液应用前新鲜配制。

11. “O”因子血清。

3.样品制备及增菌培养

    如为冷冻食品，应于2～5℃下不超过18h解冻。若不能及时检验，应放于－15℃保存，最多不能超过2d。非冷冻易腐的食品应置于4℃冰箱保存，最多不得超过3d。

    无菌操作称取剪碎后的样品25g(猪舌应剪取舌根、舌两侧及舌尖部肉)，置于装有225mL改良的磷酸盐缓冲液的500mL广口玻璃瓶中，充分振荡(若采用均质，可将剪碎后的样品25g置于灭菌均质杯内，加入25mL已灭菌的改良磷酸盐缓冲液，以8000～10000r/min均质0.5min，再将均质好的样品置入装有200mL改良的磷酸盐缓冲液的500mL广口玻璃瓶中，充分振荡)，然后于25℃培养48±2h。吸取该培养液1mL移种于预先预热到25℃的装有9mL的5g/L氢氧化钾溶液的试管中，使之充分混合0.5min。立即吸取该混合液2mL移种于预先预热到25℃的装有8mL的改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤的试管中，充分混合，于25℃培养4～6h。

4.分离培养

4.1.将上述经改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤增菌的培养液摇匀，以直径3mm的接种环分别挑取一环划线于表面无凝固水的含吐温80的亚硫酸铋琼脂平板和含吐温80的麦康凯琼脂平板各一个，培养于25℃，含吐温80的亚硫酸铋琼脂平板培养3～4d，含吐温80的麦康凯琼脂平板培养48±2h。

4.2.观察各琼脂平板，有无典型或可疑耶氏菌菌落。

耶氏菌的菌落特征见表1：

表1  小肠结肠炎耶尔森氏菌菌落特征