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总蛋白的六种检测方法

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总蛋白的六种检测方法

(一)凯氏定氮法

将血清与强酸一起加热消化,使血清中的含氮化合物转化为铵盐,再加碱使铵盐成为氨进经蒸馏分离出来,最后用酸滴定测定氮量,按每克氨相当于6.25g蛋白质计算蛋白质的浓度。

应用历史较久,结果较准确,是蛋白质测定的参考方法,但操作复杂,影响因素较多,且不少蛋白质的含氮量并非16%,不适用于日常工作,目前多用于标准蛋白的标定及校正其它的常规方法。

(二)双缩脲法

蛋白质中的肽键(-CONH-)在碱性条件下与Cu2+络合成紫红色复合物,产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质含量成正比。

此反应和二分子尿素缩合后的产物双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与碱性铜溶液作用形成紫红色的反应相似,故称为双缩脲反应。几分子中含有两个甲酰胺基(-CO-NH2)的化合物都能出现此反应。

因至少含2个-CONH-基团才能与Cu2+络合,所以氨基酸和二肽无此反应。体液中小分子肽含量极低,故血浆中除蛋白质外几乎不存在可与双缩脲试剂显色的物质,且各种蛋白质显色程度基本相同。

此法简便、准确、重复性好,在10-120g/L。浓度范围内呈良好的线性关系,批内CV值<2%,但灵敏度较其它方法稍差,是目前临床上最常规的方法。

(三)酚试剂法

蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物。Lowry改良法在酚试剂中加入Cu2+,提高了呈色的灵敏度,其中75%呈色靠铜离子产生。Lowry改良法的灵敏度为双缩脲法的100倍左右。

由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸的比例不同,如白蛋白含色氨酸为0.2%,而在一些球蛋白中色氨酸含量高达2%~3%,因此使用本法测定纯粹的、单一的蛋白质较合适。此法灵敏度较高,为10~60ug/ml,因而适用于测定蛋白质含量较少的标本(如脑脊液),但试剂反应易受还原性化合物糖类、酚类及多种药物如水杨酸、氯丙嗪和某些磺胺药的干扰。

(四)紫外分光光度法

蛋白质分子内的色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm波长处有一吸收峰,依此性质可用于蛋白质定量。

由于各种蛋白质中芳香族氨基酸的含量和比例不同,血清中游离的酪氨酸和色氨酸在280nm处也有吸收,因尿酸和胆红素在280nm处也有干扰,因而本法的准确性和特异性都受到很大的影响。

此法敏感而且简便,由于制剂未经任何处理,蛋白质的生物活性得以保留,故常用于较纯的酶和免疫球蛋白的测定。但此法需紫外分光光度计和石英比色杯。

(五)染料结合法

在酸性环境中,蛋白质分子解离出的-NH3+,可与染料的阴离子产生颜色反应。常用的染料有氨基黑、考马斯亮蓝等。这一性质可用于电泳后蛋白质的染色和血清总蛋白测定。

此法操作简便、重复性好、灵敏度高、且干扰因素较少。缺点是特异性不高,分子量3 000以上的多肽也参与反应。另外,不同蛋白质和染料的结合力不一致,因此很难找到一种合适的物质作标准物,使此方法的应用受到。

(六)比浊法

用某些酸类(如二氯醋酸、磺基水杨酸等)和血清蛋白质结合产生沉淀,然后测定其浊度,与同样处理的蛋白标准液比较,即可求得蛋白质含量。

此方法简便,不需特殊仪器。缺点是浊度形成的强弱易受多种因素影响,如加入试剂的方法、反应时的温度等。另外,蛋白质沉淀时易形成絮状物,难以获得稳定的悬浮液。

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