・５０・ ２０１１年９月第３８卷第１８期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＰｒａｃｔｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ ＳｅＤ２０１１．Ｖ０１．３８．Ｎ０．１８ ．ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ真核表达载体的构建及其抗肝癌细胞效应 贾萌 【摘要】 目的 构建ＡＦＰ启动子介导的ＨＳＶ／ＴＫ重组真核表达载体，并研究其荷瘤效应。方法ＰＣＲ扩增 ＡＦＰ基因启动子、ＨＳＶ—ＴＫ基因，将上述片断插入ＥＧＦＰ—Ｎ１载体的多克隆位点，从而构建甲胎蛋白启动子下 ＨＳＶ—ＴＫ基因重组表达载体ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ。将其注射移植性Ｈ２２肝癌模型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠，并设转染空质粒 ｐｃＤＮＡ３．１组，观察两组的抗肿瘤效应。结果结论肝癌特异性真核表达载体ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ构建成功，该真核表达 载体免疫荷瘤小鼠后，ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ组肿瘤细胞生长受到抑制，且该组生存期长于ｐｃＤＮＡ３．１组（Ｐ＜０．０５）。 在受试动物体内可有效的诱导特异性抗肿瘤免疫应答。 【关键词】 甲胎蛋白启动子；自杀基因；聚合酶链反应；荷瘤小鼠 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＧＦＰ——ＡＦＰ——ＴＫ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉ——ｈｅｐａ－－ ｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ＪＩＡ Ｍｅｎｇ．Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００３，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｔ— ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）ｐｒｏｍｏｔｅｒ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ＨＳＶ／ＴＫ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ，ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ ｉｔｓ ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｚａ— ｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｂｅａｒｉｎｇ ｔｕｍｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ＡＦＰ ｇｅｎｅ，ＨＳＶ—ＴＫ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ａｍ— ｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ａｂｏｖｅ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＧＦＰ—Ｎ１，ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ，ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ Ｃ５７ ＢＬ／６Ｊ ｍｉｃｅ ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｈ２２ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ，ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｌｌｏｃａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ａｓ ｐｃＤＮＡ３．１ ａｎｄ ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ．Ｔｈｅ ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ—ｓｐｅ— ｃｉｉｃ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｆｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃａｒｒｙｉｎｇ ＡＦＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ＨＳＶ／ＴＫ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ，ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ— ＴＫ，ｗａｓ ｓｕｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｗａｓ ｓｌｏｗｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ Ｉｏｎ— ｇｅｒ ｏｆ ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｐｃＤＮＡ３．１ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｂｅａｒｉｎｇ ｔｕｍｏｒ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ｔＬＬＩｍｏｒ 一ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ；Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｍｉｃｅ ｂｅａｒｉｎｇ 肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后 了减少这种风险，可选择一种使ＨＳＶ—ＴＫ基因只在肝 差。尽管其诊治水平不断提高，但世界上每年因肝癌致 死的患者仍达百万人之多。近年来肝癌的自杀基因疗 癌细胞中表达的启动子。蔡晓坤等 和程香普等 报 道ＡＦＰ ０．３启动子是甲胎蛋白（ 一ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＦＰ）启 动子基因表达所需的最短序列，可ＨＳＶ—ＴＫ 基因在ＡＦＰ阳性肝癌细胞中特异表达，不良反应较小。 作者成功构建了含ＡＦＰ启动子、ＨＳＶ—ＴＫ基因的重组 法已经逐渐成为研究热点。自杀基因是指存在于细菌、 病毒和真菌中的一类基因，其编码的酶能活化一些抗 感染药物前体，从而产生细胞毒作用。单纯疱疹病毒 胸苷激酶（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ—ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ， 真核表达载体ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ，并以此为基础，接种 荷瘤小鼠，观察其诱导荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫效应，为 ＨＳＶ—ＴＫ）基因¨ 是目前研究比较详细的一种自杀基 因，它通常参与细胞ｓ期进展的，促进前体核苷酸 整合入ＤＮＡ。另外，ＨＳＶ—ＴＫ基因亦能将核苷如药物 ｇａｎｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）转化成有毒的二磷酸形式，当后者整 合人细胞ＤＮＡ后，可致ＤＮＡ链合成终止和细胞死亡。 进一步进行肝癌的体内靶向性治疗奠定基础。 １材料与方法 １．１主要试剂和仪器：性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接 酶（购自ＮＥＢ公司），ＤＭＥＭ、胎牛血清、ＯｐｔｉＭＥＭ、琼 但在通用启动子下，该系统虽可以高效地杀伤肝 癌细胞，却同样会杀伤非肝癌细胞，不良反应较大。为 ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４—４７５６．２０１１．１８．０２０ 脂糖和Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００转染试剂盒（购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司），Ｐｌａｓｍｉｄ抽提Ｋｉｔ（购自ＱＩＡＧＥＮ公司），山羊抗 人ＴＫ一抗（购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司），生物素化兔抗山 羊二抗ＩｇＧ及ＥＣＬ发光试剂盒（购自北京中山生物技 作者单位：４５０００３郑州，河南省人民医院 术公司），ＰＣＲ仪（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司）荧光显微 ２０１１年９月第３８卷第１８期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｅｐ．２０１１，Ｖｏ１．３８，Ｎｏ．１８ ・５ｌ・ 镜（奥林帕斯公司）。 １．２载体、菌株和细胞系：含ＨＳＶ—ＴＫ基因的质粒 然后将ＨＳＶ—ＴＫ片段与ＡＦＰ启动子片段进行ＰＣＲ连 接，ＰＣＲ仪进行反应按以下循环条件：９４ ３０ Ｓ、 ９４ ｃＩ＝３０ Ｓ、５５。Ｃ３０ Ｓ、７２℃３ ｍｉｎ、７２℃１０ ｍｉｎ、４ ｃＣ ｐＥＧＦＰ—ｓｃｔ—ｃｄｔｋ、大肠杆菌ＤＨ５、真核表达载体 ｐＥＧＦＰ—Ｎ１（本实验室保存），ＡＦＰ启动子（上海吉凯 基因工程有限公司合成），Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠由河南省动 物实验中心提供。 保存、３０个循环，ＰＣＲ产物大小：１３８１ ｂｐ。连接后使 用Ｘｈｏ Ｉ／Ｋｐｎ Ｉ进行酶切消化。酶切反应体系：ＰＣＲ 产物（１００ ｒｉｇ／ １）５ ｌ、１０ Ｘ ｂｕｆｆｅｒ ５ ｔｘｌ、１００ Ｘ ＢＳＡ ４ ４ ７ ２ ５ ８ ２ 一 ， １．３ ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ重组真核表达载体的构建： 用Ｋｐｎ Ｉ／Ｈｉｎｄｍ切ｐＥＧＦＰ—ｓｃｔ—ｃｄｔｋ得至０ ＨＳＶ—ＴＫ ０．５ ｔｘｌ、Ｘｈｏ Ｉ（１０ Ｕ／ｔｘ１）１ ｌ、Ｋｐｎ Ｉ（１０ Ｕ／ １）１ ｌ、 Ｈ２０ ４０．５ ｌ，将上述混合的反应物置于３７℃，１ ｈ。 最后将ＰＣＲ酶切产物插入酶切真核表达载体ＥＧＦＰ— Ｎ１构建成重组真核表达载体ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ。 ２ 基因序列的片段，经琼脂糖凝胶回收纯化，分别进行 ＡＦＰ启动子和ＨＳＶ—ＴＫ引物的设计与合成。ＡＦＰ启 动子上游引物（含保护基和ＸｈｏＩ酶切位点）：５’一 ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＡＣ一３’。 １．４ ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ重组真核表达载体的鉴定： 见表１。ＰＣＲ引物用于ＰＣＲ鉴定目的基因定向连接 ４ ４ ７ ５ ８ ２ 下游引物：５’一ｃＧＧＧＴＡｃｃＡＡＧｃｃＡ１ｖｒｃＧＴＴＧｃＴＡＧＴ一 ＴＡ１＿ＩＷＧ一３’。首先调取ＡＦＰ启动子，ＰＣＲ仪按以下 循环条件进行反应：９４ ３０ Ｓ、９４ ３０ Ｓ、５５℃３０ Ｓ、 ７２ ３ ｒａｉｎ、７２℃１０ ｍｉｎ、４℃保存，３０个循环，ＰＣＲ 产物大小：２４７ ｂｐ。ＨＳＶ—ＴＫ基因上游引物：５’一 ｃＴＡＧｃＡＡｃｃＡＡＴＧｃｃＴＴｃＧＴＡｃｃｃｃＴＧｃｃ一３’，下游 引物（含保护碱基和Ｋｐｎ Ｉ酶切位点）：５’一ＧＧＧＧ一 ＴＡｃＣＧＴＧＴＴＡＧｃｃＴｃｃｃＣＣＡＴＣＴＣＣ一３’。其次调取 的阳性克隆菌落。ＨＳＶＴＫ—ＳＥＱＦ引物（＋）：ＴＧＧＧＣ－ ＣＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＧ。ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＳＥＱＲ引物（一）： ｃＧＴｃＧｃｃＧＴｃｃＡＧｃＴｃＧＡｃｃＡＧ。ＰＣＲ仪进行反应按 以下循环条件：９４℃３０ Ｓ、９４℃３０ Ｓ、６０℃３０ Ｓ、７２℃ ３０ Ｓ、７２℃６ ｍｉｎ、４ ｏＣ保存，３０个循环，ＰＣＲ产物大 小：２７０ ｂｐ。 菌落ＰＣＲ模板：在连接转化产物长出菌 ４ ４ ７ ２ ５ ８ ２ ） ４ ４ ７ ２ ５ ８ ２ 克隆表面沾一下，溶于１０ ｌ ＬＢ，混匀取１ ｌ作为模 板；阴性对照：排除系统中外源核酸污染导致假阳性结 ＨＳＶ—ＴＫ基因，ＰＣＲ仪按以下循环条件进行反应： ９４ ３０ Ｓ、９４℃３０ Ｓ，５５ ３０ Ｓ、７２℃３ ｒａｉｎ、７２℃ 果；阳性对照：以确定的含有引物要钓取的其他目的基 因的载体作为模板，如ＧＡＰＤＨ基因，以排除ＰＣＲ反应 ４ ４ ７ ５ ８ ２ ２ １０ ａｒｉｎ、４℃保存，３０个循环，ＰＣＲ产物大小：１１５９ ｂｐ。 试剂 引物（＋） 体系的异常造成的假阴性结果。 鉴定组２ 鉴定组３ 鉴定组４ ４ ４ ７ 表１ ＰＣＲ反应体系（ １） 阴性对照组 阳性对照组 鉴定组１ 鉴定组ｎ ２ ｎ ５ ８ ２ 引物（一） ｄｄＨ２Ｏ １０ Ｘ缓冲液 ＭｇＣ１２（１．５ ｍＭ） ４ ４ ７ ２ ５ ８ ２ ＤＮＴＰｓ（２．５ ｍＭ） Ｔａｑ聚合酶 模板 总量 １．５ ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ重组真核表达载体的转化、 观察肿瘤情况及生存期。 扩增：用氯化钙法 将其转化入大肠杆菌ＤＨ５，大量 扩增，保存备用。 １．６．２荷瘤小鼠生存期观察：免疫后第７天，受试小鼠 分别腹腔注射肝癌Ｈ２２细胞，建立小鼠腹水模型。每日 定时测量实验组及对照组动物体质量，观察其生存期。 １．７统计学方法：应用ＳＰＳＳ １０．０版统计学软件进行 两样本均数比较的ｔ检验，检验水准ａ＝０．０５。 ２ 结果 １．６ ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ真核表达载体的抗肿瘤免疫 效应检测： １．６．１ 动物免疫：将６～８周龄健康纯系雄性 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ／ｂ鼠随机分为两组，每组２Ｏ只，给小鼠双侧 股四头肌分别注射盐酸布比卡因（２．５ ｇ／Ｌ）５０ ｌ。３ ｄ 后分别进行免疫接种。各小组分别于第０、１０、２０天各 接种１次。实验设两组。ｐｃＤＮＡ３．１组每鼠注射ｐｃＤ— ＮＡ３．１空质粒１００ Ｉｘｇ／次，ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ真核表 达载体组每鼠注射ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ真核表达载体 １００ 次。３次免疫后受试小鼠建立荷瘤小鼠模型， ２．１ ＡＦＰ启动子和ＨＳＶ—ＴＫ基因的ＰＣＲ调取结果及 其两个基因片段连接后的酶切鉴定：ＡＦＰ启动子和 ＨＳＶ—ＴＫ基因的ＰＣＲ调取如图１所示，显示的２个片 段大小与预期值（０．２５ ｋｂ和１．２ ｋｂ）一致。然后将 ＡＦＰ启动子和ＨＳＶ—ＴＫ基因连接后经酶切反应体系插 入ＥＧＦＰ—Ｎ１载体构建成重组表达载体ｐＥＧＦＰ一 ・５２・ 医刊２０１１年９月第３８卷第１８期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｅｏ２０１１．Ｖ（）１．３８．Ｎｏ．１８ ．ＡＦＰ—ＴＫ经ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ酶切，显示的个１片段大小约为 １．４ ｋｂ，与预期值大小一致，重组表达载体构建成功。 １ ２ ３ １ ２ 图１ 图２ 图１ ｌ：ＡＦＰ启动子ＰＣＲ产物，约为０．２５ ｋｂ；２：ｍａｒｋｅｒ： ５ ｋｂ，３ ｋｂ，２ ｋｂ，１．５ ｋｂ，１ ｋｂ，７５０ ｂｐ，５００ ｂｐ，２５０ ｂｐ，１００ ｂｐ；３： ＨＳＶ—ＴＫ ＰＣＲ产物，约为１．２ ｋｌ１ 图２ ｌ：Ｍａｒｋｅｒ：从上至下分别为５ ｋｈ，３ ｋｈ，２ ｋｂ，１．５ ｋｈ， １ ｋｂ，７５０ ｂｐ，５００ ｂｐ，２５０ ｂｐ，１００ ｂｐ；２：ＡＦＰ启动子与ＨＳＶ—ＴＫ 连接后的ＰＣＲ酶切产物，约为１．４ ｋｈ ２．２ ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ重组真核表达载体的鉴定结 果：ＰＣＲ阳性克隆鉴定图片见图３。 ’ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ 图３ ＰＣＲ阳性克隆鉴定图片 １：阴性对照（ｄｄＨ Ｏ）；２：阴性对照（空载组）；３：阳性对照 （有确定插入片段的载体组）；４：Ｍａｒｋｅｒ：５ ｋｂ，３ ｋｂ，２ ｋｂ， １．５ ｋｈ，１ ｋｂ，７５０ ｂｐ，５００ ｂｐ，２５０ ｂｐ，１００ ｂｐ；５：ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一 ＡＦＰ—ＰＲＯＭＯＴＥＲ—ＨＳＶＴＫ一１：６：ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＡＦＰ—ＰＲＯ— ＭＯＴＥＲ—ＨＳＶＴＫ一２：７：ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＡＦＰ—ＰＲＯＭＯＴＥＲ— ＨＳＶＴＫ一３；８：ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＡＦＰ—ＰＲＯＭＯＴＥＲ—ＨＳＶＴＫ一４； ９：ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＡＦＰ—ＰＲＯＭＯＴＥＲ—ＨＳＶＴＫ一５：１０：ｐＥＧＦＰ— Ｎ１一ＡＦＰ—ＰＲＯＭＯＴＥＲ—ＨＳＶＴＫ一６ ２．３真核表达载体ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ诱导荷瘤小鼠 抗肿瘤免疫效应结果：真核表达载体ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ— ＴＫ对荷瘤小鼠生存期的影响：真核表达载体ｐＥＧＦＰ— ＡＦＰ—ＴＫ小鼠生存期［（１４．１±１．７）ｄ］长于ｐｃＤ． ＮＡ３．１空质粒组［（１０．１±１．３３）ｄ］，ｔ＝一４．４７３， Ｐ＜０．０５。 ３讨论 肿瘤的自杀基因治疗是指将自杀基因导人肿瘤靶 细胞并使之表达，基因编码的酶将无毒的药物前体转 化为具有细胞毒性的代谢物，从而诱导靶细胞产生自 杀效应杀伤肿瘤细胞，同时还通过旁观者效应杀伤临 近未转染的肿瘤细胞 Ｊ。采用自杀基因治疗的系统 种类较多，主要包括单纯疱疹病毒Ｉ型胸苷激酶／丙氧 鸟苷（ＨＳＶ１一ＴＫ／ＧＣＶ）系统、带状疱疹病毒胸腺嘧啶 激酶／阿糖甲氧基嘌呤（ＶＺＶ—ＴＫ／Ａｒａ—Ｍ）系统 等＿＿Ｊ。其中ＨＳＶ１一ＴＫ／ＧＣＶ系统在肝癌自杀基因治 疗中研究的最为透彻、应用最为广泛。 目的基因进入靶细胞必须通过载体介导才能实 现，基因治疗的靶向性已成为决定基因治疗效果 及可行性的关键因素。甲胎蛋白（ＡＦＰ）通常存在于 大量的肝癌细胞中和一些其他的肿瘤细胞中，大多数 肝癌患者ＡＦＰ水平都有升高，而且这种表达增高是由 ＡＦＰ基因的５’一旁侧序列在转录水平上的。目 前研究表明，甲胎蛋白启动子能够目的基因在 ＡＦＰ阳性肝癌组织细胞中特异性表达。Ｋａｎｅｋｏ等 用该旁侧序列作为ＴＫ基因的启动子，构建重组 腺病毒载体ＡＶ１一ＡＦＰ—ＴＫ用以转染产生和不产生 ＡＦＰ的２株肝癌细胞（ＨｕＨ７、ＳＫ—Ｈｅｐ一１），发现只有 产生ＡＦＰ的ＨｕＨ７细胞有ＴＫ活性，ＧＣＶ处理后出现 死亡。而用Ｒｏｕｓ肉瘤病毒启动子代替ＡＦＰ启动子构 建的病毒载体进行相同实验，则２株细胞均有ＴＫ活 性，并且都能被ＧＣＶ杀死。可见使用由ＡＦＰ启动子 ＴＫ基因的腺病毒载体可达到靶向性转基因的 目的。 本研究成功构建了以ＡＦＰ启动子的真核表 达载体ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ。用肝癌Ｈ２２细胞移植建 立Ｃ５７ＢＬ／６荷瘤小鼠模型，观察ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ对 荷瘤小鼠肿瘤生长水平的影响，结果显示，ＥＧＦＰ— ＡＦＰ—ＴＫ组荷瘤小鼠寿命长于ｐｃＤＮＡ３．１组（Ｐ＜ ０．０５）。上述结果提示，ｐＥＧＦＰ—ＡＦＰ—ＴＫ真核表达 载体在体内可以有效的提高受试动物特异性抗肿瘤免 疫水平，杀伤肿瘤细胞，抑制移植肿瘤的生长，延长荷 瘤小鼠的寿命，产生抗肿瘤免疫效应。 参考文献 ［１］Ｈａｄａｃｚｅｋ Ｐ，Ｍｉｒｅｋ Ｈ，Ｂｅｒｇｅｒ ＭＳ，ｅｌ ａ１．Ｉ ｉｍｉｔｅｄ ｉｃａｅｙ ｔ＇ｒ ｇｅｌｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅＸ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ／ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ『Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，２００５，１０２（２）：３２８．３３５． ２０１１年９月第３８卷第１８期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＰｒａｃｔｉｃａｌＭｅ ｎｅ ｅｐ． ： ： ： ・５３・ ］Ｊ ］１Ｊ １Ｊ 蔡晓坤，周俊立，周鹤俊，等．ＡＦ０．３启动子的ＰＮＰ／ＭｅＰ— ［６］ Ａｓｋｌｕｎｄ Ｔ，Ａｐｐｅｌｓｋｏｇ ＩＢ，Ａｍｍｅｒｐｏｈｌ Ｏ，ｅｔ ａ１．Ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ。 ｄＲ系统对ＡＦＰ阳性肝癌细胞的特异杀伤作用［Ｊ］．癌症，２００６， ｔｅｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ ２５（１１）：１３３４－１３３９． ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＳＶ／ｔｋ ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ， 程香普，金中奎，段芳龄，等．分泌ＡＦＰ的人肝癌细胞株中阳离 ２００３，２８４（２）：１８５—１９５． 子脂质体介导肝癌组织特异性载体的表达［Ｊ］．郑州大学学报医 ［７］ Ｎｉｃｈｏｌａｓ ＴＷ，Ｒｅａｄ ＳＢ，Ｂｕ￣ｏｗｓ ＦＪ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ 学版，２００４，３９（４）：６１３－６１６． Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ 杨文宇，黄宗海，汤福祥，等．“两步转化法”高效制备携带自杀 ｗｉｔｈ ｃｏｎｎｅｘｉｎｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔｓ［Ｊ］． 基因的重组腺病毒载体［Ｊ］．第一军医大学学报，２００４，２４（２）： Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ，２００３，１８（２）：４９５－５０７． １６４—１６７． （收稿日期：２０１１—０８一Ｏ１） Ｅｒｉｃａ Ｇｏｌｅｍｉｓ．蛋白质相互作用——分子克隆手册［Ｍ］．北京：中 （本文编辑：杨帆） 国农业出版社，２００４：１０． 两种不同方法清洗呼吸机管路的效果观察及评价 邵春梅柴西英 申明媚 高海英 【摘要】 目的探讨两种不同方法清洗呼吸机管路的效果。方法对患者使用后的呼吸机管路分别采用人 工刷洗的方式一５％的有效氯清洗消毒剂浸泡（实验组）和全自动清洗消毒机严格消毒程序方法消毒（对照组），于 消毒后采样进行细菌培养及细菌菌落计数。结果 实验组和对照组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０．Ｏ１）。结论 采用清洗消毒机清洗消毒呼吸机管路是非常安全有效的，可避免交叉感染，使工作更加规范化。 【关键词】 呼吸机管路；全自动清洗消毒机；清洗；消毒 Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｂｙ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ＳＨＡＯ Ｃｈｕｎ—ｍｅｉ，ＣＨＡＩ Ｘｉ—ｙｉｎｇ， ＳＨＥＮ Ｍｉｎｇ—ｍｅｉ，ＧＡＯ Ｈａｉ—ｙｉｎｇ．Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｅｎｔｅｒ，ｔｈｅ Ｆｒｉｓｔ Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｇｑｉｕ，Ｓｈａｎｇｑｉｕ ４７６１００，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｕｓｅｄ ｂｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｏａｋｉｎｇ ｄｉｓ— ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ５％ａｖａｉｌａｂｌｅ ｃｈｌｏｒｉｎｅ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ）ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｉｃｔ ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌｌ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｃｌｅａｎｉｎｇ—ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌ－ ｔｕｒｅｄ ａｆｔｅｒ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（ＣＦＵ）ｗｅｒｅ ｃｏｕｎｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｅｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ（Ｐ＜ ０．０ １）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｕｌｌ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｃｌｅａｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ ａｒｅ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｓａｆｅｒ．Ｔｈｅ ｍａｃｈｉｎｅ ｃａｎ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｎｄ— ａｒｄｉｚｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｗｏｒｋ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ ｃｉｒｃｕｉｔ；Ｆｕｌｌ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｃｌｅａｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ；Ｃｌｅａｎｉｎｇ；Ｄｉｓ— ｉｎｆ Ｃｔｉｎｎ 机械通气是目前临床上应用较多的呼吸衰竭抢救 自动清洗机清洗消毒的安全性，现报告如下： 措施之一，呼吸机管路通过气管插管与呼吸道黏膜相接 １资料与方法 触，如果管道清洗消毒不严会引起交叉感染，给医院和 １．１ 一般资料：回收医院重症监护病房、急诊室、神经 患者增加负担。２００９年４月卫生部新行标的颁发，给消 内科、神经外科、呼吸科等呼吸机管路１５０套，鲁沃夫 毒供应专业提出了更高更新的要求，我院于２００９年５ 低泡碱性清洗剂、全自动清洗消毒机、纯水机、烘干机、 月统一由消毒供应中心规范了呼吸道管路的管理，同年 一次性无菌无纺布、无菌包（内有１２０ ｅｍ Ｘ １２０ ｃｍ双 的７月至９月，笔者分别对回收到消毒供应中心的呼吸 层棉包布３～６块，无菌纱布２００块）。 机管路由人工手洗的方法和全自动清洗消毒机严格消 １．２方法： 毒程序清洗消毒两种不同方法进行细菌培养，以确认全 １．２．１ 消毒方法：采用方法Ａ：将回收呼吸机管路中 的其中５０套采用即把５０套管道先浸泡在适宜温度和 ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４—４７５６．２０１１．１８．０２１ 浓度的酶洗液中５～１０ ｍｉｎ，将污染的管道和湿化器各 作者单位：４７６１００河南省商丘市第一人民医院 连接部位打开，用水冲洗后泡入加盖的含氯２０００ ｍｇ／Ｌ
