鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗对1日龄低母源抗体水平雏鸡免疫效果的研究

雏鸡免疫效果的研究

章振华;李林;景小冬;张建伟;沈佳;史爱华;郑小兰;黄凤军;姜北宇

【摘 要】将鸡传染性法代囊病病毒(IBDV) BX株抗原和IBDV高免血清按一定比例混合,初步制备了无菌的鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗1～5(分别含有32、8、4、0.5及0.125单位IBDV中和抗体),用鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗1～5及BX株活疫苗分别免疫1日龄低母源抗体水平雏鸡,免疫后9d观察法氏囊病变,免疫后28 d采血测定IBDV中和抗体,并用强毒攻击,计算各组疫苗保护率.结果显示,免疫后9d,复合物疫苗1～3免疫组鸡法氏囊正常,复合物疫苗4、5免疫组和BX株活疫苗免疫组分别有2/10、4/10和5/10的试验鸡法氏囊出现了病变;免疫后28 d,复合物疫苗1～5免疫组和BX株活疫苗免疫组IBDV中和抗体效价分别为8.34log2、9.60log2、9.21log2、7.88log2、9.50log2和9.12log2,攻毒保护率分别为90％、100％、100％、80％、90％和80％.试验结果表明鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗2、3(分别含8、4单位IBDV中和抗体)免疫1日龄低母源抗体水平的雏鸡效果最好,攻毒保护率能达到100％. 【期刊名称】《中国畜牧兽医》 【年(卷),期】2015(042)009 【总页数】6页(P2493-2498)

【关键词】鸡传染性法氏囊病;免疫复合物疫苗;法氏囊;保护率

【作 者】章振华;李林;景小冬;张建伟;沈佳;史爱华;郑小兰;黄凤军;姜北宇

【作者单位】北京市农林科学院畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京100097 【正文语种】中 文 【中图分类】S852.4

鸡传染性法氏囊病（IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的雏鸡急性、接触性传染病，不仅能使雏鸡发病死亡，而更重要的是IBDV 破坏雏鸡中枢免疫器官——法氏囊，导致不同程度、甚至长期的免疫抑制［1－2］。控制鸡传染性法氏囊病的重要措施之一是进行疫苗免疫接种。目前市场上应用的灭活疫苗包括传染性法氏囊病灭活疫苗、新城疫—传染性法氏囊病二联灭活疫苗、新城疫—传染性支气管炎—传染性法氏囊病三联灭活疫苗及新城疫—传染性支气管炎—禽流感（H9亚型）－传染性法氏囊病四联灭活疫苗等，灭活疫苗主要免疫蛋种鸡提高IBDV 抗体，再通过卵黄传递给雏鸡，雏鸡高水平IBDV 母源抗体可抵抗IBDV 野毒感染。应用的活疫苗按其毒力可分成弱毒、中等毒力及中等偏强毒力3种。弱毒疫苗有D78、S706、G 等毒株，虽对法氏囊无任何损伤，安全性好，但免疫原

性差，现已很少使用；目前多使用中等毒力及中等偏强毒力的疫苗，中等毒力疫苗毒株有BJ836、B87、LC75等，中等偏强毒力疫苗毒株有W2512、MB、NF8等，这些疫苗毒株免疫原性好，可以突破母源抗体的干扰，但对雏鸡法氏囊有一定程度的损伤，尤其中等偏强毒力的毒株更易导致雏鸡法氏囊严重萎缩，造成一定程度的免疫抑制［3－6］。为克服常规鸡传染性法氏囊病活疫苗的缺点，需要研制出更安全、高效的新型鸡传染性法氏囊病活疫苗。借鉴国外先进国家疫苗研制最新的技术思路，开展了鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗的研究［7－10］。本试验采用研制的鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗免疫1日龄低母源抗体水平的普通雏鸡，初步观察该疫苗对普通雏鸡的安全性及免疫效力。 1 材料与方法 1.1 材料

硫乙醇酸盐培养基（TG）、酪胨琼脂（GA）和葡萄糖蛋白胨培养基（GP）均购自北京中海生物科技有限公司。SPF鸡胚：动物免疫与预防研究室从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购进SPF 种蛋自行孵化至11日龄。试验鸡：由动物免疫与预防研究室从北京某鸡场购入低IBDV 抗体水平的京红商品蛋鸡所产种蛋，自行孵化出雏，至1 日龄时使用，1 日 龄 京 红 雏 鸡IBDV 母 源 抗 体 水 平 为25.9。IBDV 抗原：由动物免疫与预防研究室用IBDV BX株活疫苗通过接种11日龄SPF 鸡胚，经组织捣碎机匀浆制成鸡胚悬液，低速离心后取上清分装冻存于－30 ℃，病毒抗原无菌，HA 效价为0，其毒价为105.6 EID50／0.2mL。IBDV 抗血清：由动物免疫与预防研究室采用鸡传染性法氏囊病BX 株活疫苗和灭活疫苗多次免疫SPF 鸡，最后分离血清制备抗体［11］，抗体无菌，其鸡胚中和抗体效价为1∶3 346。攻毒用强毒IBDV BC6／85株由中国兽医药品监察所王栋惠赠，其毒价为104.0 BID／0.2mL，攻毒剂量为102.0 BID／0.2mL。 1.2 方法

1.2.1 鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗的制备及菌检 与IBDV BX 株活疫苗抗原量相同，固定每羽份鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗病毒抗原含量为100EID50，分别加入IBDV 抗血清，使每羽份鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗含32、8、4、0.5及0.125单位IBDV 中和抗体，在室温下混匀中和1h，配制鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗1～5。对制备的上述5种鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗进行细菌检测，分别取1 mL 鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗接种2支TG 小管、2支GA斜面和1支GP小管，TG 小管、GA 斜面和GP小管各取1支放室温（25 ℃）培养，TG 小管及GA 斜面各取1 支放37 ℃培养，观察7d并判断有无细菌生长。

1.2.2 鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗对1日龄普通雏鸡的安全性试验 将70只1日龄低母源抗体水平的雏鸡均分成7组，每组10只。第1～5组（复合物疫苗1～5免疫组）分别免疫鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗1～5，第6组（BX 株活疫苗免疫组）免疫鸡传染性法氏囊病BX 株活疫苗，免疫途径均为颈背侧皮下，剂量为1羽份（0.1mL）／只，第7组（对照组）不接种疫苗作为空白对照。免疫后每天观察各组试验鸡精神、采食、饮水及粪便等情况。免疫后9d，对各组鸡分别称重后剖杀，观察鸡法氏囊变化，取法氏囊称重，计算B／B 指数及法氏囊指数。计算公式：

B／B指数=法氏囊重量／鸡体重×1 000；

法氏囊指数=免疫组鸡B／B 指数／空白对照组鸡B／B指数

1.2.3 鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗对1日龄普通雏鸡的免疫效力试验 将70只1日龄低母源抗体水平的雏鸡均分成7组。第1～5组（复合物疫苗1～5免疫组）分别免疫鸡传染性法氏囊病复合物疫苗1～5，第6组（BX 株活疫苗免疫组）免疫鸡传染性法氏囊病BX 株活疫苗，免疫途径均为颈背侧皮下，剂量为1羽份（0.1mL）／只，第7组（对照组）不接种疫苗作为空白对照。免疫后28d，对7

组试验鸡各组10只鸡称重、采血，对血样分离血清测定IBDV 中 和 抗 体，然 后 用IBDV BC 6／85 株 强毒经滴鼻点眼途径攻毒，0.2mL／只（含100BID），其中滴鼻点眼各0.1mL。攻毒后观察鸡群状况，攻毒后72h，对所有攻毒鸡剖杀，观察鸡法氏囊变化，计算各组试验鸡攻毒保护率。 1.2.4 IBDV 中和抗体测定试验

1.2.4.1 鸡胚成纤维细胞的制备及培养 取10～11日龄发育良好的SPF鸡胚，用强力碘消毒卵壳。以无菌手术取出胎儿，去除眼、脑、四肢、内脏后放入50mL无菌离心管内，剪成约1mm3 的小块，用Hank’s液清洗两次，再加入与鸡胚悬液等体积的0.25%胰蛋白酶溶液（pH 7.2），38 ℃水浴消化6～8min，吸出胰蛋白酶溶液，用Hank’s液清洗两次，再用DMEM 液清洗一次后，吹打分散细胞，加适量DMEM 液后静置2～3min，上层悬浮细胞液用8层纱布过滤，下层沉淀继续吹打分散细胞两次，收集的细胞悬液计数后加入含10%胎牛血清的DMEM 液，使鸡胚成纤维（CEF）细胞悬液含细胞数70～80 万／mL。在96 孔细胞培养板各孔中加入CEF细胞液0.10mL，置37 ℃、5%CO2 培养箱培养24h，待细胞长成单层。

1.2.4.2 微量滴定法测定血清IBDV 中和抗体

试验前将待检血清在56 ℃水浴灭活30min。首先在96孔微量细胞培养板（第1套板）加入DMEM液，每孔加0.05mL，取待检灭活血清0.05 mL 加入到第1孔内，充分混匀后取0.05mL加入到第2孔内，进行2倍系列稀释，从1∶21、1∶22、1∶23……稀释到1∶224。血清稀释完后，从1∶224至1∶21 方向分别在上述各孔内加0.05mL（即与血清等体积）的病毒悬液（滴度为200TCID50／0.025 mL），充分振荡混合，37 ℃温箱作用1h；将长满CEF 细胞单层的培养板（第2 套板）弃去上清液，每孔加入0.15mL含2%胎牛血清的DMEM 培养液；从1∶21至1∶224方向将第1块板每孔0.05mL病毒中和液移入第2套板相应孔

内，一个样品一个吸头。将细胞培养板振荡30s。试验时设置CEF 细胞正常对照、阴性血清对照、阳性血清对照及病毒对照。第2套细胞培养板置37 ℃、5%CO2 温箱培养，观察5d，判定血清IBDV 中和抗体效价。 2 结果与分析

2.1 鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗的制备及菌检结果

固定每羽份鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗病毒抗原含量为100EID50，使每羽份鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗含32、8、4、0.5及0.125单位IBDV 中和抗体，成功制备了鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗1～5。对制备不同抗体含量的鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗进行细菌检测，1mL鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗分别接种TG 小管、GA 斜面和GP小管，培养7d后均无菌生长，结果表明制备的鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗菌检阴性。 2.2 鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗的安全性试验结果

在9d观察期内，鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗和BX 株活疫苗免疫鸡均未出现不良反应，免疫鸡精神、采食、饮水及粪便等同对照组试验鸡一样正常。免后9d，对所有试验鸡称重，复合物疫苗1～5免疫组鸡平均体重在101.33～104.68g之间，对照组鸡平均体重为103.16g，而BX 株活疫苗免疫组鸡平均体重为101.13g，所有试验组鸡体重没有明显差异；剖杀试验鸡，复合物疫苗1～3免疫组鸡法氏囊没有萎缩，法氏囊大小、色泽、弹性基本与对照组鸡相同；复合物疫苗4、5免疫组分别有2／10和4／10的试验鸡法氏囊出现了病变，具体表现为黄化、出现白色斑点、囊内有黏液；BX 株活疫苗免疫组有5／10的试验鸡法氏囊出现了病变，具体表现为萎缩、囊内皱褶变薄不清晰；计算7 组试验鸡平均B／B指数及复合物疫苗1～5免疫组和BX 株活疫苗组鸡平均法氏囊指数，结果显示复合物疫苗1～3免疫组鸡平均法氏囊指数在0.92～1.00之间，BX株活疫苗组鸡平均法氏囊指数为0.77（表1）。结果表明鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗1～3

对1日龄低母源抗体水平雏鸡免疫比BX 株活疫苗免疫更为安全。

表1 疫苗免疫1日龄低母源抗体水平雏鸡的安全性试验结果Table 1 The safety experiment results of one－day old low maternal antibody chickens immunized with vaccines组别 鸡数（只） 平均体重（g）平均法氏囊重（g） 平均B／B指数 平均法氏囊指数GroupsNo.ofMean bodyMean weightMean B／B indexMean bursa chickensweightof bursa of fabriciusof fabricius index复合物疫苗1免疫组10 104.68 0.394 3.76 0.92 Immune complex vaccine 1group复合物疫苗2免疫组 10 103.23 0.421 4.08 1.00 Immune complex vaccine 2group复合物疫苗3免疫组 10 101.33 0.392 3.87 0.95 Immune complex vaccine 3group复合物疫苗4免疫组 10 101. 0.366 3.59 0.88 Immune complex vaccine 4group （2／10病变）复合物疫苗5免疫组 10 104.22 0.423 4.06 0.99 Immune complex vaccine 5group （4／10病变）BX 株活疫苗免疫组 10 101.13 0.317 3.13 0.77 BX strain vaccine group （5／10病变）对照组Control group 10 103.16 0.422 4.09／

2.3 鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗的免疫效力试验及抗体测定试验结果 免疫后28d，复合物疫苗1～5免疫组鸡平均体重 分 别 为310.68、308.98、314.96、293.83 和300.84g，BX 株活疫苗组和对照组鸡平均体重分别为320.13和300.77g。结果表明研制的鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗免疫1日龄低母源抗体水平雏鸡后，没有影响免疫鸡的生长发育。免疫后28d，对照组鸡抗体IBDV 中和抗体下降至0.38log2，复合物疫苗1～5免疫组IBDV 中和抗体效价分别为8.34log2、9.60log2、9.21log2、7.88log2和9.50log2，BX 株活疫苗免疫组抗体效价为9.12log2。免疫后28d攻毒，攻毒后观察3d，对照组鸡表现出明显的临床发病症状，如精神萎顿、羽毛逆立、拉稀等，剖检法氏囊全部呈阳性病变，如水肿、黄化、充血、出血、内有胶冻样物等病变；复合物疫苗2、3免疫组攻毒

保护率均达到100%（10／10），复合物疫苗1、4、5免疫组和BX 株活疫苗免疫组攻毒保护率分别为90%（9／10）、80%（8／10）、90%（9／10）和80%（8／10）。结果表明鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗2、3（分别含8、4单位IBDV 中和抗体）免疫1日龄低母源抗体水平的雏鸡效果最好，攻毒保护率能达到100%（表2）。 3 讨 论

免疫复合物疫苗是一种新型疫苗，是将特异性高免血清（抗体）按照适当的比例与传染性病毒混合制成的一种新型疫苗。国内外研究者开展了鸡新城疫、鸡传染性喉气管炎及鸡传染性贫血等免疫复合物 疫 苗 的 研 究［7，12－18］，其 优 点 在 于 安 全 性 高 和 免 疫效果比常规疫苗更好。目前中国市场上应用的中等毒力及中等偏强毒力的鸡传染性法氏囊病活疫苗毒株对雏鸡法氏囊均有一定程度的损伤，造成雏鸡对其他疫苗接种产生免疫抑制，鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗免疫1日龄雏鸡，不会过早损伤雏鸡法氏囊，有效避免产生免疫抑制反应。本研究制备了含不同单位IBDV 中和抗体的鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗，对1日龄低母源抗体水平的雏鸡进行免疫试验，免疫后9d，复合物疫苗1～3免疫组雏鸡法氏囊没有萎缩，而BX 株活疫苗免疫组有5／10的试验鸡法氏囊出现了病变，研究结果表明鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗1～3比BX 株活疫苗更为安全，免疫后雏鸡法氏囊正常发育，没有肉眼可见病变；免疫后28d，复合物疫苗2～3免疫组和BX 株活苗免疫组IBDV 中和抗体效价分别为9.60log2、9.21log2和9.12log2，攻毒保护率分别为100%、100%和80%。由此可见，鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗中含有过高或过低的IBDV 中和抗体，疫苗产生的免疫效力与常规活疫苗相当，攻毒保护率在80%～90%，只有当免疫复合物疫苗中抗原抗体比例最佳时，疫苗免疫效力最好，攻毒保护率达100%，这与宋立芹等［13］、毕英佐等［14］研究结果一致。免疫复合物疫苗中抗体过量，会抑制免疫复合物对免疫淋巴细胞的

刺激作用，抗体过少又不能保护活病毒免受机体免疫系统的攻击和延缓病毒的释放，导致和常规活疫苗一样，在免疫后9d内导致法氏囊发生病变，只有当免疫复合物疫苗中抗原、抗体适量，复合物才能产生高效的免疫刺激［9］。

表2 免疫后28d试验鸡抗体测定及攻毒结果Table 2 The results of antibody determination and challenge to experimental chickens at the 28th day after immunization免疫后28d28days after immunization G组ro别upsNo鸡.of数 ch（i只c k）ens平均体重（g）IBDV 抗体效价（log2） 保护率（%）Mean body weightAntibody titer of IBDVProtection rate复合物疫苗1免疫组 10 310.68 8.34 90（9／10）Immune complex vaccine 1group复合物疫苗2免疫组 10 308.98 9.60 100（10／10）Immune complex vaccine 2group复合物疫苗3免疫组 10 314.96 9.21 100（10／10）Immune complex vaccine 3group复合物疫苗4免疫组 10 293.83 7.88 80（8／10）Immune complex vaccine 4group复合物疫苗5免疫组 10 300.84 9.50 90（9／10）Immune complex vaccine 5group BX 株活疫苗免疫组 10 320.13 9.12 80（8／10）BX strain vaccine group对照组Control group 10 300.77 0.38 0（0／10） 目前，美国、法国商品化鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗已经应用于国内市场，应用效果很好，但免疫复合物疫苗作用机理仍不十分清楚，认为免疫复合物疫苗的作用机制：①复合物能直接与滤泡树突状细胞（FDC）特异性结合［19］；②由于复合物疫苗中抗体分子Fc片段与APC的Fc受体亲合性高，疫苗中病毒更有效地结合APC［12］。本试验研究结果也显示，当免疫复合物疫苗中抗原、抗体在恰当比例时（含8、4单位IBDV 中和抗体），在9d的安全观察期内，对低IBDV 母源抗体水平的普通雏鸡法氏囊没有损伤；免疫后28 d，IBDV 中和抗体在9.21log2以上，保护率达100%。与活病毒疫苗相比，鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗呈现了更好的安全性和更高的免疫效力。

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