一种链霉素高产菌株及其筛选方法[发明专利]

*CN1032938A*

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 1032938 A(43)申请公布日 2013.09.11

(12)发明专利申请

(21)申请号 201310242675.2(22)申请日 2013.06.19(83)生物保藏信息

CGMCC No.6219 2012.06.14

(71)申请人河北圣雪大成制药有限责任公司

地址051430 河北省石家庄市栾城县圣雪路

50号(72)发明人贾晓乐 刘丽芳

(74)专利代理机构石家庄国域专利商标事务所

有限公司 13112

代理人白海静(51)Int.Cl.

C12R 1/5(2006.01)

C12N 1/20(2006.01)C12N 15/01(2006.01)C12N 13/00(2006.01)

()发明名称

一种链霉素高产菌株及其筛选方法(57)摘要

本发明公开了一种链霉素高产菌株，同时提供上述菌株的筛选和发酵方法。本发明提供的链霉素高产菌株名称为灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)DC622，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNO.6219，保藏日期为2012年06月14日。本发明公开的筛选方法主要包含以下步骤：（a）原始菌株孢子液获得；（b）孢子悬液的诱变；(c)耐高磷菌株的筛选；(d)高产菌株的筛选；(e)高产菌株保存。本发明还公开了一种DC622菌株的筛选方法。该方法筛选所得的DC622菌株其平均发酵效价可达到14908U/mL。CN 1032938 A权利要求书1页 说明书3页 附图1页权利要求书1页 说明书3页 附图1页

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权 利 要 求 书

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1.一种链霉素高产菌株，其特征在于该菌株的名称为灰色链霉菌(Streptomycesgriseus) DC622，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6219 ，保藏日期为2012年06月14日。

2.根据权利要求1所述的链霉素高产菌株，其特征在于所述其形态特征外在表现色为白色，形状近似梅花状，菌落中心凹陷。

3.根据权利要求1所述链霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：a、取链霉素出发菌株接种于斜面培养基，在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%的条件下培养5-8天，挑选斜面培养基上的孢子，加入生理盐水，制成孢子浓度为107-109个/mL的孢子悬浮液；

b、使用微波对孢子悬浮液进行诱变40秒，然后再对其进行紫外光照射120秒，避光培养30 分钟，得到诱变孢子液；

c、将诱变孢子液接种到钒酸钠浓度为0.3-0.7 mg/mL的液体培养基中，在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%条件下，180 rpm震荡培养15-28 h，分离后得到分离菌株，将分离菌株接种到钒酸钠浓度为0.5-1.0 mg/mL的固体双碟培养基上，在温度27.0±1.0℃，相对湿度30%-60%条件下培养2-3天，得到耐高磷菌株，再将耐高磷菌株转接到含硫氨基酸浓度为0.03-0.07 mg/mL的固体双碟培养基上，在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%条件下培养5天，得到成熟的单菌落；

d、将单菌落转接到斜面培养基上，在温度27.0±1.0℃，自然湿度条件下培养5-7天得到成熟的斜面孢子，使用液氮保存成熟孢子；

e、将保存的成熟孢子转接到液体培养基中，在温度27.0±1.0℃、自然湿度（具体数值？）的条件下，180 rpm震荡培养8-10天，筛选出发酵产率的菌株进行保藏 即获得灰色链霉菌(Streptomycesgriseus) DC622。

4.权利要求2所述链霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述微波，其频率为300MHz，微波处理时间30-50 s，所述紫外光的波长为257.3nm，紫外灯的功率为15W，紫外处理时间100-140 s。

5.权利要求2所述链霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于，步骤（3）中所述的含硫氨基酸为蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸中的任意一种。

6.权利要求2所述链霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于，方法中所述的斜面培养基、固体双碟培养基，按质量比计，其组成为酵母膏100-150份，葡萄糖100-120份，磷酸氢二钾5-8份，硫酸镁5-8份，琼脂200-250份；用20%氢氧化钠溶液将培养基的pH值调节至6.7±0.1。

7.权利要求2所述链霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于，所述液体培养基，按质量体积比计算，其成分为：酵母膏6.0-8.0%，葡萄糖6.0-8.0%，磷酸二氢钾0.8-1.2%，硫酸镁 0.05-0.08%，其余为水；用20%氢氧化钠溶液将培养基的pH值调节至7.0±0.1。

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说 明 书

一种链霉素高产菌株及其筛选方法

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技术领域

本发明涉及一种用于生产抗生素的菌株及其筛选方法，具体地说是一种链霉素高

产菌株及其制备方法。

[0001]

背景技术

链霉素是瓦克斯曼(Waksman S1A1)于1944年发现的第一个氨基糖苷类抗生素，

它对结核杆菌有强大的抗菌作用,同时对许多革兰氏阴性菌(G-)如大肠杆菌、肺炎杆菌、肠杆菌属、沙门菌属、布鲁菌属等也具有一定的抗菌作用。目前用于链霉素发酵的菌株主要为灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、比基尼链霉菌等。灰色链霉菌，其外表颜色如名所述呈灰色，孢子梗直而短，单菌落生长丰满，呈梅花型或馒头型，直径为3-4 mm，基质菌丝透明，在斜面背后产生淡褐色色素。目前筛选出的、用于链霉素发酵的灰色链霉菌株，其生产能力较低。因此如何提高链霉素菌株的发酵能力，进而提高链霉素产量，降低生产成本，一直本领域科研人员研究的重点课题之一。

[0002]

发明内容

本发明的目的是提供一种链霉素的高产菌株，同时提供一种该菌株的筛选方法，

以期提高链霉素的产量，解决链霉素在生产过程中菌种生产能力较低的问题。 [0004] 为实现本发明的目的，本发明提供了一种链霉素高产菌株，其名称为灰色链霉菌(Streptomycesgriseus) DC622，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6219，保藏日期为2012年06月14日。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 [0005] 本发明所提供的DC622菌株其微生物学特征如下：

该菌株的菌落为白色，近似梅花状，菌落中心凹陷。

[0006] 本发明所提供的链霉素高产菌株DC622的筛选方法，包括以下步骤：

a、取链霉素出发菌株接种于斜面培养基中，在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%的条件下培养5-8天，挑选斜面培养基上的孢子，加入生理盐水，制成孢子浓度为107-109个/mL的孢子悬浮液；

b、使用微波对孢子悬浮液进行处理，然后再对其进行紫外光照射120秒，避光培养30 分钟，得到诱变孢子液；

c、将诱变孢子液接种到钒酸钠浓度为0.3-0.7 mg/mL的液体培养基中，在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%条件下，180 rpm震荡培养15-28 h，分离后得到分离菌株，将分离菌株接种到钒酸钠浓度为0.5-1.0 mg/mL的固体双碟培养基上，在温度27.0±1.0℃，相对湿度30%-60%条件下培养2-3天，得到耐高磷菌株，再将耐高磷菌株转接到含硫氨基酸浓度为0.03-0.07 mg/mL的固体双碟培养基上，在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%条件下培养5天，得到成熟的单菌落。

[0003] [0007]

d、将单菌落转接到斜面培养基上，在温度27.0±1.0℃，自然湿度条件下培养5-7

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说 明 书

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天得到成熟的斜面孢子，使用液氮保存成熟孢子；

e、将保存的成熟孢子转接到液体培养基中，在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%~60%的条件下，180 rpm震荡培养8-10天，筛选出发酵产率高的菌株进行保藏即获得灰色链霉菌(Streptomycesgriseus) DC622。

[0008] 本发明步骤b中所述微波处理，其频率为300MHz，微波处理时间30-50 s，所述紫外光的波长为257.3nm，紫外灯的功率为15W，紫外处理时间100-140 s。 [0009] 本发明步骤c步中所述的含硫氨基酸为蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸中的任意一种。

[0010] 本发明方法中所述的斜面培养基和固体双碟培养基，按质量份数计，其成分为：酵母膏100-150份，葡萄糖100-120份，磷酸氢二钾5-8份，硫酸镁5-8份，琼脂200-250份；用20%氢氧化钠溶液将培养基的pH值调节至6.7±0.1；

本发明所述液体培养基，按质量体积比计算，其成分为：酵母膏6.0-8.0%，葡萄糖6.0-8.0%，磷酸二氢钾0.8-1.2%，硫酸镁 0.05-0.08%，其余为水；用20%氢氧化钠溶液将培养基的pH值调节至7.0±0.1。

[0011] 本发明提供的DC622菌株是一种链霉素高产菌株。该菌株的发酵产量比普通菌株的产量高出30%-50%，该菌株发酵水平为：摇瓶培养8天时检测链霉素效价，其平均效价为14908 U/mL。

[0012] 附图说明：

图1：本发明菌株的固体双碟菌落形态图。具体实施方式

[0013] 以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的。 [0014] 若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 [0015] 实施例1：DC622菌株的筛选

1．培养基的准备 (1)斜面培养基、固体双碟培养基配方、制备方法相同，即按质量份数计，其成分为：酵母膏130g，葡萄糖100g，磷酸氢二钾7g，硫酸镁6g，琼脂230g；用20%氢氧化钠溶液将培养基的pH值调节至6.7±0.1，在0.11±0.01MPa、121℃±1℃下，消毒20 min，冷却到室温待用。

[0016] (2)液体培养基，按质量体积比计算，其成分为：酵母膏70.0g，葡萄糖80.0g，磷酸二氢钾10.0g，硫酸镁 0.6g，加水定容至1000ml；用20%氢氧化钠溶液将培养基的pH值调节至7.0±0.1；在0.11±0.01MPa、121℃±1℃下，消毒20 min，冷却到室温待用。 [0017] (3)含钒酸钠固体双碟培养基配方：在固体双碟培养基中加入钒酸钠，使培养基中钒酸钠的含量达到0.5 mg/mL；

(4)含钒酸钠的液体培养基配方：在液体培养基中加入钒酸钠，使培养基中钒酸钠的含量达到0.7 mg/mL；

使培养基中(5)含蛋氨酸的固体双碟培养基配方：在固体双碟培养基中加入蛋氨酸，

蛋氨酸的含量达到0.05 mg/mL。[0018] 2．原始菌株孢子液获得

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说 明 书

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出发菌株为灰色链霉菌（编号为4.1095，购自中国科学院微生物研究所）。取出4.1095菌株砂土管，无菌条件下用接种针蘸取少量孢子接种于斜面培养基上，在27.0±1.0℃，相对湿度30%-60%的条件下培养8天，挑选成熟的斜面孢子加入到10 mL生理盐水中，制备孢子悬浮液，悬浮液中孢子浓度约为108个/mL。[0019] 3．孢子液诱变

采用微波诱变和紫外诱变交替的方法进行诱变，先使用微波（频率300MHz）对孢子液诱变40 s，然后再使用紫外光（波长257.3nm，紫外灯功率15W）对其诱变120 s，避光培养30 min，得到诱变后的孢子液。

[0020] 4．高产菌株筛选

将诱变后的孢子液按3%的接种量接入钒酸钠浓度为0.7 mg/mL的液体培养基中，在温度27.0±1.0℃，相对湿度30%-60%的条件下，180 rpm震荡培养20 h，将液体培养基进行分离，得到的菌落接种于钒酸钠浓度为0.5 mg/mL的固体双碟培养基上，在温度27.0±1.0℃，相对湿度30%-60%条件下培养3天，然后将固体双碟上的单菌落转接到蛋氨酸浓度为0.05 mg/mL的固体双碟上，在温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%条件下培养5天，得到成熟的单菌落。[0021] 挑选上述单菌落（如图1所示，其白色，近似梅花状，中心凹陷。）接种到固体斜面培养基上，在温度27.0±1.0℃，相对湿度30%~60%的条件下培养5天后得到成熟的斜面孢子，使用液氮保存成熟孢子。

[0022] 将保存的孢子以及出发菌株的孢子，按3%接种量分别接种到数个相同的液体培养基（即分为若干个组，如表1中的A1-A5组及对照组）中，培养条件为温度27.0±1.0℃、相对湿度30%-60%，180 rpm震荡培养8天。培养结束后，用高效液相色谱测定各组中（A1-A5）链霉素的效价（检测结果见表1）。选择平均效价的最高（14908 U/ml）组所对应的菌株，命名为DC622菌株，同时进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.6219，保藏日期为2012年06月14日。 [0023] 表1 效价检测结果

组别

效价检测1(U/mL)效价检测2(U/mL)效价检测3(U/mL)平均效价(U/mL)

A113798137801378513788

A214830148251482314826

A314830148321482614829

A414902149141490914908

A514876148701487314873

对照98309828359831

从表1可见，本发明所筛选出的DC622菌株，其发酵产率高。

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说 明 书 附 图

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图1

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