过氧化物酶活性的测定

实验三

（一）过氧化物酶活性的测定（愈创木酚法）

一、实验目的

通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法和原理。 二、实验原理

以愈创木酚为底物，在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm波长处有最大光吸收值，故可通过测470nm波长下的吸亮度变化测定过氧化物酶的活性。

三、材料、设备和原理 1. 材料马铃薯块茎

2. 设备光亮度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管

3. 试剂已配置好的反应混合液、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液 四、 操作方法 1.酶液制备

取1g 去皮洗净的马铃薯块茎，入 20mmol/LKH2PO 4 溶液5ml于研钵中 1. 把马铃薯块茎研磨成浆 把马铃薯浆放于离心机中，在3000r/min下离心10min 上清液转入25ml容量瓶中定容 2．比色测定 取2只一只比色杯 半径为中加3ml反 5cm比混合五、实验结果应 色杯 液,KH2PO4溶液1ml,时间（min）0123456710 为参比液

一只比色杯加反应混合液3ml，酶液10分钟内测定的酶液吸亮度 1ml 把2只比色杯放入分光亮度计中，调到470nm 每隔1min读数1次，连续测10min A4700.1260.2570.3850.5130.6020.6940.70.8750.9991.0411.119

酶液标准曲线10.8吸0.6亮度0.4值0.20012345678时间（min）系列1线性(系列1) 计算：

酶活力（0.01A470/min）=

A2−A1(t2−t1)×0.01

×𝐷

0.875−0.385=×25 (7−2)×0.01=245.0

酶的比活力（μ/g）=

酶活力（μ）样品重(g)或样品中蛋白质的含量（mg）

六、讨论

1、由于仪器较少,等待测POD值的时间较长,且没有放在低温下保持。导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。

2、理论上POD值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系。可能原因有①把酶液加入到3ml反应混合液时，反应太快，待到1min读取POD值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。②离心出来的酶液在室温下放置时间过长。

245.0==246.08 0.9956

（二）可溶性蛋白质含量的测定（考马斯蓝G-250法）

一、实验目的

掌握测量可溶性蛋白的方法及其原理。 二、实验原理

可溶性蛋白质与考马斯蓝G-250反应生成青色产物，在595nm波长有最大吸收峰，其颜色深浅与可溶性蛋白含量成正相关，可用分光亮度法测定可溶性蛋白的含量。

三、材料、设备和原理 1.材料马铃薯提取液

2.设备分光亮度计、10ml刻度试管、移液管 3.试剂考马斯蓝G-250、100μg/ml标准蛋白液 四、操作方法 1. 标准曲线制作 在各试 以100μg即：在6 管中加 标准蛋白支试管中在考马斯595nm取10ml 液为母液分别加蛋蓝刻度试 配制成0、白液0、下，测定管6只 20、40、60、试剂80 、100的系列浓度标准蛋白体积/ml 蛋白液 蒸馏水体积/ml 考马斯蓝G-250/ml 蛋白质含量/g 0.2、0.4、0号 0.8、1号 0.6、1.0ml,0.00 并0.20 加蒸馏水 1.00 0.80 5 0 5 20 G-250，2摇匀号 3号 0.40 0.60 5 40 0.60 0.40 5 60 各管吸4号 5号 亮度0.80 0.20 5 80 1.00 0.00 5 100 以蛋白含量为横轴，A595为纵轴，绘制标准曲线

2. 样品液测定

样品液：1ml提取液（ 0.5ml提取液+0.5ml 蒸馏水）+5ml考马斯蓝 G-250 五、实验结果 浓度（μg/ml）00.20.40.60.81.0 A59500.1260.2190.3440.4680.597

空白：1mlKH2PO4+5ml考马斯蓝G-250 放于分光亮度计中，595nm下测吸亮度 标准蛋白液的吸亮度值 标准蛋白液标准曲线0.70.60.5吸亮0.4度0.3值0.20.1000.20.40.60.81蛋白液浓度（ug/ml）1.2y = 0.0059xR² = 0.9976系列1线性(系列1) 计算：

实验测得马铃薯提取液的吸亮度值为0.106

由Y=0.0059x得 x=0.106/0.0059 =17.97μg/ml

蛋白含量

=w▪1000×V1

17.9725=×=0.902 0.9956×10000.5mV总

六、讨论

1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。

2、测定中，蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

3、其他的测定蛋白质的方法，与考纳斯蓝比色法比较存在的优缺点。

目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin

－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。

考马斯亮蓝法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。