实验三
(一)过氧化物酶活性的测定(愈创木酚法)
一、实验目的
通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法和原理。 二、实验原理
以愈创木酚为底物,在过氧化物酶(POD)催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm波长处有最大光吸收值,故可通过测470nm波长下的吸亮度变化测定过氧化物酶的活性。
三、材料、设备和原理 1. 材料马铃薯块茎
2. 设备光亮度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管
3. 试剂已配置好的反应混合液、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液 四、 操作方法 1.酶液制备
取1g 去皮洗净的马铃薯块茎,入 20mmol/LKH2PO 4 溶液5ml于研钵中 1. 把马铃薯块茎研磨成浆 把马铃薯浆放于离心机中,在3000r/min下离心10min 上清液转入25ml容量瓶中定容 2.比色测定 取2只一只比色杯 半径为中加3ml反 5cm比混合五、实验结果应 色杯 液,KH2PO4溶液1ml,时间(min)0123456710 为参比液
一只比色杯加反应混合液3ml,酶液10分钟内测定的酶液吸亮度 1ml 把2只比色杯放入分光亮度计中,调到470nm 每隔1min读数1次,连续测10min A4700.1260.2570.3850.5130.6020.6940.70.8750.9991.0411.119
酶液标准曲线10.8吸0.6亮度0.4值0.20012345678时间(min)系列1线性(系列1) 计算:
酶活力(0.01A470/min)=
A2−A1(t2−t1)×0.01
×𝐷
0.875−0.385=×25 (7−2)×0.01=245.0
酶的比活力(μ/g)=
酶活力(μ)样品重(g)或样品中蛋白质的含量(mg)
六、讨论
1、由于仪器较少,等待测POD值的时间较长,且没有放在低温下保持。导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。
2、理论上POD值与时间的关系曲线应为抛物线,但实际测出来的曲线大体为线性关系。可能原因有①把酶液加入到3ml反应混合液时,反应太快,待到1min读取POD值时,反应已经过了指数增长期,处于缓慢增长状态。②离心出来的酶液在室温下放置时间过长。
245.0==246.08 0.9956
(二)可溶性蛋白质含量的测定(考马斯蓝G-250法)
一、实验目的
掌握测量可溶性蛋白的方法及其原理。 二、实验原理
可溶性蛋白质与考马斯蓝G-250反应生成青色产物,在595nm波长有最大吸收峰,其颜色深浅与可溶性蛋白含量成正相关,可用分光亮度法测定可溶性蛋白的含量。
三、材料、设备和原理 1.材料马铃薯提取液
2.设备分光亮度计、10ml刻度试管、移液管 3.试剂考马斯蓝G-250、100μg/ml标准蛋白液 四、操作方法 1. 标准曲线制作 在各试 以100μg即:在6 管中加 标准蛋白支试管中在考马斯595nm取10ml 液为母液分别加蛋蓝刻度试 配制成0、白液0、下,测定管6只 20、40、60、试剂80 、100的系列浓度标准蛋白体积/ml 蛋白液 蒸馏水体积/ml 考马斯蓝G-250/ml 蛋白质含量/g 0.2、0.4、0号 0.8、1号 0.6、1.0ml,0.00 并0.20 加蒸馏水 1.00 0.80 5 0 5 20 G-250,2摇匀号 3号 0.40 0.60 5 40 0.60 0.40 5 60 各管吸4号 5号 亮度0.80 0.20 5 80 1.00 0.00 5 100 以蛋白含量为横轴,A595为纵轴,绘制标准曲线
2. 样品液测定
样品液:1ml提取液( 0.5ml提取液+0.5ml 蒸馏水)+5ml考马斯蓝 G-250 五、实验结果 浓度(μg/ml)00.20.40.60.81.0 A59500.1260.2190.3440.4680.597
空白:1mlKH2PO4+5ml考马斯蓝G-250 放于分光亮度计中,595nm下测吸亮度 标准蛋白液的吸亮度值 标准蛋白液标准曲线0.70.60.5吸亮0.4度0.3值0.20.1000.20.40.60.81蛋白液浓度(ug/ml)1.2y = 0.0059xR² = 0.9976系列1线性(系列1) 计算:
实验测得马铃薯提取液的吸亮度值为0.106
由Y=0.0059x得 x=0.106/0.0059 =17.97μg/ml
蛋白含量
=w▪1000×V1
17.9725=×=0.902 0.9956×10000.5mV总
六、讨论
1、如果要求严格,最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为这段时间内颜色是最稳定的。
2、测定中,蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上,不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)。可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
3、其他的测定蛋白质的方法,与考纳斯蓝比色法比较存在的优缺点。
目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin
-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。
考马斯亮蓝法的突出优点是:
(1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。 (3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
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