羟基和超氧自由基的检测研究进展

来源：爱问旅游网

第29卷,第4期　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析2009年4月　　　　　　　　　　　　SpectroscopyandSpectralAnalysisVol129,No14,pp109321099

April,2009　

羟基和超氧自由基的检测研究进展

张　昊,任发政3

中国农业大学食品科学与营养工程学院,教育部2北京市功能乳品实验室,北京　100083

摘　要　活细胞在必需的新陈代谢过程中会产生自由基,越来越多的研究证据表明,这些自由基涉及到许

多体内系统,然而一旦有过多的自由基生成便会氧化细胞脂膜、蛋白质、DNA和酶,进而对细胞造成致命性的损伤。此外,研究还表明许多疾病与自由基密切相关,例如,有研究报道海氏默症病人脑中生物分子的氧化损伤程度明显高于正常值,另外癌症可能也是DNA受到氧化损伤的结果。因此,测定自由基的方法就显得十分必需和重要。文章重点对羟基和超氧自由基检测技术的发展情况进行了讨论,涉及的自由基检测技术主要有分光光度法、荧光法、化学发光法和电子自旋共振技术,并评价了各种方法的优缺点。关键词　羟基自由基;超氧自由基;检测技术;评述中图分类号:O65713　　文献标识码:A　　DOI:10139/j1issn1100020593(2009)0421093207羟基苯甲酸,用其在510nm处的吸光度值表示OH・的多

少,吸光度值与OH・的量成正比[1]。11112　铁氧化邻二氮菲法

Fenton反应产生OH・,羟自由基使邻二氮菲2Fe2+氧化为邻二氮菲2Fe3+,使邻二氮菲2Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失。根据536nm处吸光度变化判断受试物清除OH・的能力。需要注意的是,测定时加样方法对结果有重要影响,需先将邻二氮菲、PBS及水混匀,并且每管加入FeSO4后立即混匀,否则会使局部颜色过浓,影响结果的重复性[2]。11113　细胞色素C氧化法

其反应机理为OH・能使还原型细胞色素C(浅红色)氧化成氧化型细胞色素C(浅黄色)通过测定反应体系中吸光度的减少量(550nm),间接测得OH・的含量。11114　脱氧核糖法

采用Fe3+2EDTA2抗坏血酸2过氧化氢体系产生OH・。此方法中脱氧核糖作为OH・的攻击目标。脱氧核糖受OH・攻击后裂解,在酸性、加热的条件下可与硫代巴比妥酸反应生成红色化合物。可根据在532nm处测定的吸光度值来间接反映OH・的含量[3]。11115　萃取2催化氧化光度法

利用混合稀土溶液催化H2O2产生OH・,OH・氧化二苯基碳酰肼,生成红色二苯基碳酰腙,其最大吸收波长是563nm。当二苯基碳酰肼浓度一定时,吸光度值与OH・呈

引　言

)和超氧自由基(O2-・)是生物体内　　羟基自由基(OH・

活性氧代谢产生的物质,其中O2-・经一系列反应最终会生成OH・,而OH・是一种氧化性很强的自由基,可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,使糖类、蛋白质、核酸及脂类等发生氧化损伤。研究表明肿瘤、心血管、衰老等许多疾病与自由基相关。

因此,近些年来人们为了预防这类疾病的发生,自由基的研究已逐渐成为热点。而快速、灵敏和实用的自由基检测方法就显得十分重要。本文主要介绍了目前常见的测定羟基和超氧自由基的检测方法:包括分光光度法、荧光法、化学发光法、电子自旋共振技术等,并评价了各种方法的优缺点和应用范围。

1　分光光度法

　　利用自由基使显色剂发生颜色变化,根据吸光度的变化值而间接测得自由基的含量是分光光度法的基本原理,下面将分别介绍几种常见的羟基和超氧自由基的测定方法。111　羟基自由基11111　水杨酸法

Fenton反应产生OH・,OH・氧化水杨酸得到2,32二　收稿日期:2007211228,修订日期:2008203206

　基金项目:国家“十一五”科技支撑项目(2006BAD05A16)资助

　作者简介:张　昊,1984年生,中国农业大学食品科学与营养工程学院硕士研究生　　e2mail:david1hao@sina1com

3通讯联系人　e2mail:renfazheng@2631net

1094光谱学与光谱分析　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第29卷

在酸性条件下,亚与氨基苯磺酸和N2甲奈基二氨基乙烯反应生成红色化合物,后者在550nm处有最大吸收峰,测定在550nm处的吸光度变化,可以间接的反映O2-・的含量,但是该方法存在一定的缺点,如甲萘胺溶液不稳定、空白值较大等。

总体上来说,分光光度法操作简单,费用少,仪器设备价格低廉,但存在检测的灵敏度较低,检测限较高,专一性不强等缺点。

量效关系,从而间接反映OH・的含量[4]。

另外还有许多研究者利用不同显色剂检测OH・,详细介绍见表1。

Table1　Determinationmethodsofhydroxylradical显色剂

亮绿溴邻苯三酚红罗丹明B亚甲基蓝苋菜红茜素紫二甲亚砜

测定波长/nm

632560558663510560420

参考文献

5671011

2　荧光法

211　荧光光度法

112　超氧自由基

超氧自由基的分光光度法测定,最常用的方法有细胞

色素C的超氧自由基还原法[12]和硝基四氮唑篮(nitroblue

tetrazolium,NBT)还原法[13]。具有氧化活性的细胞色素C

被O2-・还原后,形成了在波长550nm处有强吸收的亚铁细胞色素,可以用于O2-・的测定[14]。但是,细胞色素C还原法的体系中如果存在着其他还原性物质便会对结果造成干扰,如还原性酶的干扰。同样,NBT在O2-・的作用下,还原生成不溶于水、蓝色的二甲替(Diformazan)[13],它的最大吸收波长560nm,吸光系数达10000以上,测定灵敏度相当高。有研究者在进行KIO42H2O2化学发光反应体系的机理过程中,使用NBT反应测定O2-・获得良好的结果[15]。但是,由于二甲替不溶于水,长时间放置会出现沉淀现象,难以应用于测定O2-・随时间增长其动态的变化。

Sutherland等报道了利用水溶性NBT衍生物测定O2-・的

方法,解决了生成物沉淀所导致的测定困难问题[16]。近些年,还不断有研究者报道新的测定方法。比如田益玲等建立了一种利用动力学分光光度法测定中药对超氧阴离子自由基清除率的新方法。研究表明:当波长为520nm、黄嘌呤氧化酶浓度为4×10-3μg・mL-1,反应时间在2～7

min时,可得到最佳测定条件[17]。

另外分光光度法测定O2-・的方法还有邻苯三酚自氧化[18]、没食子酸自氧化[19]、62羟多巴胺自氧化、肾上腺素氧化法[20]和羟胺氧化法等。其中邻苯三酚自氧化是最经典的方法,但其机理十分复杂。没食子酸自氧化的测定受pH与没食子酸的浓度影响较显著,所以测定时要严格控制pH且要准确配制规定浓度的没食子酸溶液。此外样品中的其他低分子量氧化还原性物质也会直接与O2-・反应,从而影响测定结果的准确性。62羟多巴胺自氧化的优点是可在生理pH值(pH714)环境下测定,而缺点在于62羟多巴胺氧化的线性区间非常有限,而且OH・和O2-・都可以使62羟多巴胺自氧化,因此测定的专一性不高。肾上腺素氧化法以肾上腺素氧化为肾上腺素红作为O2-・生成的指标。测定

310nm处肾上腺素红的产量可间接测出反应体系的O2-・

用荧光光度法来检测自由基的含量时,使用的捕获剂

在捕获自由基后会发生荧光强度的变化。在常见的捕获剂

中,荧光强度减弱的捕获剂有Ce、罗丹明6G、水杨基荧光酮,而荧光增强的有苯甲酸、Hantzsch反应等,下面就分别从这两方面介绍常见捕获剂的应用。21111　荧光减弱的捕获剂

方光荣等研究了OH・与Ce3+的反应,表明在酸性条件下,有强荧光的Ce3+被氧化生成无荧光的Ce4+。测定反应前后荧光强度的下降可间接测定羟基自由基的含量,该方法可作为筛选抗氧化剂的方法[21]。碱性介质中罗丹明6G能产生特征荧光,其最大激发波长和发射波长分别为350和550nm,Mn2+2H2O2体系在碱性介质中产生的羟自由基可以迅速氧化罗丹明6G使其荧光猝灭,如果存在抗氧化物质可以清除羟自由基,便会使溶液的荧光猝灭程度降低,据此建立了测定抗氧化活性的方法[22]。任凤莲等人的实验发现Co2+与H2O2反应生成羟自由基的产率比Fenton试剂高100倍以上。采用水杨基荧光酮(salicylfluorone,SAF)2Co2+2H2O2荧光法测定羟自由基的新体系,激发波长和发射波长为510和500nm,测定体系在反应前后的荧光变化,可间接测定羟自由基的产生量[23]。除了这几种常见的捕获剂外,还有一些研究者采用了其他的试剂,荧光素钠本身能产生特征荧光,其激发波长和发射波长分别为491和512nm。在碱性介质中,Mn2+2H2O2体系产生的羟自由基可以迅速氧化荧光素钠使荧光猝灭[24]。张爱梅等提出检测Fen2ton反应产生羟自由基的方法。羟自由基与吖啶红发生反应后,吖啶红的荧光强度减弱,测定其荧光强度的变化,可间接测定羟自由基的产生量[25]。21112　荧光增强的捕获剂

张海容等通过Cu+催化过氧化氢2抗坏血酸反应体系产生羟自由基模型,根据羟基苯甲酸的荧光大小对比研究了亚钠、槲皮素和红色素对羟自由基的清除能力。结果表明:高粱红色素、亚钠、槲皮素对OH・自由基的清除能力呈一定的量效关系,亚钠、槲皮素优于红色素对羟自由基的清除能力。探讨了红色素、槲皮素、亚钠的猝灭机理,表明红色素、亚钠为动态猝灭,槲皮素为静态

[26]

猝灭过程。谷学新等利用Fenton反应产生的羟基自由基氧化DMSO生成的甲醛与乙酰丙酮、氨发生Hantzsch反应,产物3,52二乙酰21,42二氢吡啶产生特征荧光,其最大

含量。该法操作简便,而且灵敏度可以设法增加,但干扰因素较多。在羟胺氧化法中O2-・可氧化羟胺生成亚根,

第4期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析激发波长和最大发射波长分别为41914和50515nm。通过测定荧光强度的变化可以间接定量测定羟基自由基的产生量[27]。212　荧光探针法

随着科学技术的发展,目前在自由基的研究领域中很多情况下需要测定细胞内自由基的含量,应用荧光探针法便可以达到这一目的。荧光探针法测定技术的核心是荧光探针,探针本身应该没有荧光或只有很弱的荧光,能很容易通过细胞膜,但在细胞或细胞器内被自由基氧化后发出较强的荧光。此法的优点是操作简便、快速、方便且重复性好,可在单细胞水平对细胞内活性氧进行定位定量的动态监测,因此这一方法最近发展最为迅速。但该方法目前尚未完全成熟及标准化,所使用的设备较为昂贵。

常用的荧光探针有2,72二氯荧光黄乙酰乙酸(2,72di2chlorodihydrofluo2resceindiacetate,DCF2DA)、双氢罗丹明123(DHR)、二氢乙锭(dihydroethidine,HE)等。DCF2DA具有亲脂性,很容易通过细胞膜,进入细胞后在细胞内脂酶的作用下脱去乙酸盐基团成为有极性的DCFH,但DCFH不产生荧光,细胞胞浆中的氧化物能够氧化DCFH为能发出很强荧光的2,72二氯荧光素(dichlorofluorescein,DCF),DCF形成量与细胞氧化物水平成正比例关系,因此,其荧光强度间接代表细胞内过氧化物的水平。研究表明,DCF2DA探针可被多种活性氧如O2-・、OH・、过氧化亚硝基等氧化形成DCF,因此DCF的荧光强度应是细胞内活性氧产生的总体状况的反映。HE能自由透入细胞内被O2-・直接氧化成溴化乙锭(EB),EB的荧光强度与O2-・浓度成正比,从而间接反映O2-・的含量。Catter等(CatterWO,etal.J.Lcukoe.Biol.,1994,55(2):253.)用HE作探针测得的结果表征O2-・的含量。使用DCFH2DA与DHR时,仪器的激发波长488nm,发射波长在525或530nm左右;使用HE时,仪器的激发波长488nm,发射波长在610或650nm左右。测胞浆内自由基,往往用DCFH2DA探针;而测线粒体内的自由基,则常用DHR作荧光探针[28]。

Tang等合成了用于O2-・识别的新型荧光探针试剂22吡啶甲醛苯并噻唑啉,该探针试剂只能被O2-・氧化,而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在测定波长下的荧光发生变化,所以探针试剂对O2-・具有专一性,由此建立了流动注射荧光法测定O2-・的方法[29]。之后他们又合成了新的荧光探针试剂香草醛缩282氨基喹啉,建立了新的测定O2-・的方法,并用于一串红植物衰老过程中O2-・产生速率的测定[30]。

荧光探针法的实际操作中,应注意以下几个问题:(1)探针在水溶液中易水解,应用无水乙醇或DMSO配制,4℃保存,1周内使用;(2)荧光探针在光线的照射下易被氧化。另外,还受孵育温度的影响,所以染色时需要37℃避光孵育。样品应在染色2h内上机检测,避免荧光减弱,影响实验结果;(3)细胞与探针的孵育时间必需足够,因为细胞内自由基的绝对水平很低,孵育时间过短很难显示出不同细胞间自由基水平的差异;(4)实验中应设立阴性对照,以避免细胞自身荧光对实验结果的干扰;(5)细胞应保持良好的

1095

活性状态,贴壁细胞在消化处理时要尽量温和、快速。PBS漂洗时间不必过长,以保持细胞活性,并且保证细胞内游离探针有一定的浓度。

3　化学发光技术

　　化学发光测定法是仪器分析中灵敏度最高的方法之一,已在医学、环境以及工业分析等许多领域里得到广泛的应用[31]。自由基的化学发光研究也是自由基测定法研究领域中比较活跃的分支之一。化学发光的原理是从一个化学反应(一般是氧化反应)中获得能量,使反应物或产物分子的电子激发,形成电子激发态,当返回基态时,以发射光子的形式释放能量,这一过程称为化学发光(chemiluminescence,CL)。

常利用化学发光技术间接检测食品、药品以及生物制剂中自由基清除剂,评价它们的抗氧化能力。其优势是利用了发光试剂与自由基反应后能直接发光的原理,根据光强度,确定自由基的含量。

最常用的发光试剂为鲁米诺(Luminol),鲁米诺在碱性溶液中(pH10左右),首先形成单价阴离子,然后在催化剂,如酶,Fe2+,Co2+,Ni2+和Cu2+等过渡金属离子或者金属络合物的催化下与溶液中的溶解氧或者过氧化氢发生氧化还原反应,生成激发态的两价阴离子氨基肽酸盐(APD),APD经非辐射性跃迁回到基态时,放出光子。检测光的强度就可以确定自由基含量。Zhao等以Luminol为发光试剂,检测茶叶中的茶色素清除超氧自由基与羟基自由基的能力,并将其清除能力与茶多酚进行比较。研究表明,茶色素清除O2-・和OH・的半数清除浓度达到0108和01003mg・

mL-1,其清除能力以及动力学过程与茶多酚相似[32]。

自从Albrecht报道了鲁米诺的化学发光现象以来[33],直到今天鲁米诺的化学发光反应机理仍然没有得到令人满意的阐释。近年来,有研究者在研究金属过氧化物的化学发光时发现,在不存在任何催化剂的条件下,向BaO或者MgO固体粉末中注入鲁米诺溶液,仍然可以观察到很强的发光现象[34],这一发现已被应用于以鲁米诺衍生物ABEI作为标记物的化学发光柱后测定法[35]。利用固2液非均相化学发光体系,在弱酸性或者非缓冲介质条件下,同样能够观察到鲁米诺与过氧化氢的发光现象。这些结果表明,鲁米诺发光与否与鲁米诺溶液的酸碱度似乎没有直接的关系,介质的酸碱度只会影响激发态APD的发光强度和发光波长,发光与否更多地取决于活性氧的生成条件[36],所以从理论上来说,鲁米诺化学发光法可以应用于各种不同介质中O2-・和OH・的测定,但同时这就导致了测定选择性差的问题。

另一种较常用的发光试剂是光泽精(Lucigenin),在发现鲁米诺化学发光后不久,Gleu等首次报道了光泽精化学发光[37]。在碱性条件下,光泽精与O2-・等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2methylacridan)。利用光泽精化学发光法也可检测细胞线粒体内特定种类的自由基:光泽精通过其本身的正电荷与线粒体内膜上负电荷之间的作用

1096光谱学与光谱分析　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第29卷

通过线粒体膜线粒体内膜后首先被还原成单价光泽精自由基,然后光泽精自由基与O2-・反应生成不稳定的中间物并分解出激发态分子,激发态分子跃迁到基态的过程中释放光子,通过微弱发光仪测定发光强度,以此间接测定O2-・的生成及数量。相比之下,光泽精对于自由基测定的选择性较高,有许多报道光泽精只有在超氧活性自由基存在下才发生发光现象。但是在实际应用中,H2O2的分解过程同样会产生O2-・自由基,可能会影响结果的准确性。

还有一类特殊的化学发光试剂,化学名称为22methyl262phenyl23,72dihydroimidazo2[1,22a]pyrazin232one,简称CLA,早先是由Sugiura等合成[38]的。CLA的特点是不与生物机体内的H2O2或者OH・发生反应,只与O2-・发生特异性的化学发光反应,发光波长为380nm。Osman等

)的浓度在CLA化学发光系统中加入吐温20,在016%(φ

时,CLA的发光强度增加了217倍,使检测黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系产生O2-・的灵敏度提高到nmol・L-1[40]。

Lundqvist等还开发了CLA的衍生物MCLA和FCLA[41],Nakano和Fujimori等对这一类试剂的化学发光机理和反应

[39]

Fig11　Schematicsoftrappingfreeradicalsofspintraps[46]

动力学作了详细的研究,报道了CLA和MCLA与活性氧的

化学反应机理[42,43]。FCLA是目前化学发光试剂中发光波长(532nm)最长的试剂,发光效率比CLA高出近10倍,由于这一特点,在进行生物样品中O2-・测定时,能够有效地降低酶、OH・等干扰物质的影响。

其他用于检测自由基的化学发光试剂还有Pholasin[44]

和Luminol类似物等[45,46]。

4　电子自旋共振411　自旋捕集

20世纪60年代发展的电子顺磁共振(electronparamag2neticresonance,EPR)(也称电子自旋共振(electronspinres2onance,ESR))技术在光化学、电化学、高聚物、核辐射以

及生物学领域中已得到广泛的应用。其检测自由基的原理是用某一反磁性化合物———自旋捕捉剂与不稳定的自由基反应产生一种相对稳定的可用EPR检测的自由基,一般称之为自旋加合物,利用自旋加合物的EPR常数来研究自由基的电子结构。常用的自旋捕集剂为氮氧化合物,主要为亚硝基类和硝酮类。

对于亚硝基类化合物,被捕集的自由基直接加到亚硝基的氮上[见图1(a)],所形成的自旋加合物的EPR谱可以反映被捕自由基的超精细结构,对鉴别被捕自由基十分有利。常用的捕集剂是22甲基222亚硝丁烷(MNP)。　　Li等利用了MNP的这一优点,通过EPR检测MNP自捕集所产生的自由基的超精细耦合常数的改变,研究了对2叔丁基环芳烃与自由基相互作用的情况。此类捕集剂存在的缺点是对热和光不稳定,并容易二聚而失去捕集作用,而且以O为中心的自旋加合物极不稳定[47]。

硝酮类自旋捕集剂主要有DMPO和PBN,自由基加在捕集剂的碳原子上形成加合物[见图1(b)]。

　　DMPO具有良好的水溶性,利于实验操作和溶液配制,更重要的是DMPO与O2-・和OH・反应后,所测定到的ESR谱图有明显的差别,能够快速地鉴别出O2-・和OH・。但是这个方法也存在着它的不足之处,与O2-・形成的自由基附加生成物DMPO2OOH在生理条件下,会逐渐地转变为与OH・的自由基附加生成物DMPO2OH类似的ESR信号,使得O2-・和OH・的判断成为困难,Kohno等采用向测定体系中添加DMSO的方法良好地解决了这一问题[48]。Hojo等以DMPO作为体内OH・捕集剂,用ESR自旋捕集技术间接检测小鼠血液中的体内OH・[49]。Rouband等报道一种新的DMPO的衍生物,DEPMO这一试剂可与O2-・形成稳定的自由基附加生成物(半衰期约15min),这种生成物具有特征性的12个峰的ESR信号,易于定性判断[50]。

Rhodes等以PBN为甲基自由基的捕获剂,检测一系列维生素E型的抗氧化剂与自旋捕集剂竞争甲基自由基的反应,快速测定了不同物质的活性大小以及与自由基的结合常数[51]。当所要研究的自由基为羟自由基时,由于羟自由基极不稳定,因此通常用DMSO来捕获它产生一种较稳定的甲基自由基,然后再用自旋捕集剂捕获甲基自由基,并用EPR技术进行研究。Takeshita等用DMSO来捕获大鼠体内通过X2射线产生的羟自由基,生成甲基自由基,以PBN捕获甲基自由基,通过EPR间接检测了羟自由基的含量,该结果为研究人类受辐射伤害的程度提供了一定的参考[52]。过去大多数研究认为DMSO被自由基氧化只生成了一种更稳定的甲基自由基,但是Qian等的研究表明,甲基自由基不是DMSO被氧化产生的唯一的碳自由基,除了・CH3,还有・OCH3,・CH2OH和・CH2S(O)CH3,只是后几种自由基不能用EPR检测[53]。

自旋捕集技术的局限性是:有些自旋捕获剂对生物体有毒,有些易受到血脑屏障,无法到达自由基生成的组织部位;捕集产物不稳定,寿命不长(只有几分钟到几十分钟),易被猝灭,必须在捕获自由基后立即对其检测;被捕获的自由基不专一,ESR信号随时间衰减不稳定,噪声干扰严重。412　电子自旋共振成像

随着自由基在生物体系中研究的不断深入,人们更需要了解自由基在生物组织、器官中的空间分布信息,电子自旋共振成像技术(electronspinresonanceimaging,ESRI)应

第4期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析运而生。根据成像的方式不同可分为:三维(3D)梯度磁场法、扫描EPR显微镜法、轴向检测EPR法和双共振成像法。

利用3D2EPRI技术,以TPL氮氧自由基为标记物,可清晰地获得自由基浓度随主动脉血管距心脏间的距离增加而减弱,对心脏的分辨率可达到亚毫米水平[]。Shin2ichi等给大鼠腹腔内注射一种稳定的氮氧自由基232氨甲酰基22,2,5,52四甲基212氧2吡咯啶(氨甲酰基2PROXYL),在大鼠脑部获得一个持续的自由基信号,然后将大鼠头部置于ES2RI系统的谐振腔中,通过磁场扫描,获得了大鼠脑部的3D切片ESRI图像[55]。Togashi等对大鼠尾静脉注射氨甲酰基2PROXYL,利用ESRI系统观察了大鼠腹腔氨甲酰基2PROXYL分布的2D和3D图像。在此基础上,通过CCL4诱导肝损伤,使氨甲酰基2PROXYL的代谢速率降低,又成功获得了活体大鼠肝脏的2D和3D图像[56]。Masumizu等用氮氧自由基溶剂给大鼠灌胃,观察到这种自由基首先到达胃部,然后被转运到肝、肾和心脏的动态图像[57]。另外Panagiotelis等利用射频轴向ESRI技术观察了肝、肾、膀胱

[58]

等不同组织的氧分布图像。ESRI不仅可以观察自由基在组织的空间分布,还可以观察自旋标记物在组织中的代谢情况。如Sano等采用该技术研究小鼠静脉注射不同结构的亲脂性氮氧自旋探针,获得了不同结构化合物透过血脑屏障的速度与规律,从而为活体动态研究脑组织中的自由基或药物代谢提供了新途径。

尽管ESRI技术在生物医学领域中应用已有诸多报道,参

考

1097

基于其成像原理和技术本身特点,仍有许多不利因素了ESRI的应用。比如,样本自由基的谱线较宽,为达到一定的分辨率所需的梯度场强度高;生物体内含有各向异性的顺磁性物质,从不同方向进行磁场扫描时所获得的谱线易发生偏移;由于电子与原子核的相互作用,易产生超精细结构的ESR谱线等。但这些困难必然随着人们研究的深入而逐步被克服,其发展前景非常广阔。

5　展　望

　　自由基研究已经与许多研究领域结合在一起。在食品科学领域,自由基研究可为食品中的抗氧化成分及其作用机理的研究提供有价值的参考,筛选抗氧化剂;在医学领域,生物机体的某些疾病与自由基密切相关,研究自由基的产生、消亡过程可以进一步探讨疾病的发生原理,从而为疾病诊断治疗提供理论依据;在药学领域,研究药物与自由基的相互作用、动力学过程,可为新药物的开发提供理论基础;在环境科学领域,能够利用自由基的强氧化性来实现环境中有机物的降解、转化等过程,为治理环境污染提供了一条新途径。然而从以上介绍的各种方法来看,能够直接测定自由基的方法相当有限,且到目前为止化学反应法和捕获法的分析选择性和可信度还难以令人满意。因而迫切需要开发高灵敏度、高选择性的自由基测定方法,特别是体内自由基的测定,对于解释生命机体的各种生理、病状等有着重要的意义。文

献

[1]　NicholasS,QuintonJC.Phytochemistry,19,28(4):1057.

[2]　JINMing,CAIYa2xin,LIJin2rong,etal(金　鸣,蔡亚欣,李金荣,等).ProgressinBiochemistryandBiophysics(生物化学与生物物理

进展),1996,23(6):553.

[3]　BarryH,JohnMCG,OkezieIA.AnalyticalBiochemistry,1987,165:215.

[4]　LIUDe2qi,GUJun,DINGMei2xiang,etal(刘德启,顾　钧,丁梅香,等).JournalofAnalyticalScience(分析科学学报),2002,18(2):

124.

[5]　MAQian,SUNLi2hong(马　茜,孙丽红).ChineseJournalofAnalysisLaboratory(分析试验室),2006,25(12):87.

[6]　WUNan,RENFeng2lian,WUXin2chuan(吴　南,任凤莲,吴心传).PhysicalTestingandChemicalAnalysis(PartB:ChemicalAnaly2

sis)(理化检验2化学分册),2001,37(1):10.

[7]　QINYan2he(秦延河).JournalofJiangxiNormalUniversity(NaturalScienceEdition)(江西师范大学学报・自然科学版),2005,29(6):

519.

[8]　LIFang,ZHENGHuai2li(李　方,郑怀礼).SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析),2006,26(12):2294.

[9]　YANGMing2hui,LIUMan2hong,HELi2xian,etal(杨明惠,刘满红,何丽仙,等).ChineseJournalofAnalysisLaboratory(分析试验

室),2006,25(12):77.

[10]　WUNan,RENFeng2lian,WUXin2chuan(吴　南,任凤莲,吴心传).ChemicalReagents(化学试剂),2001,23(1):42.

[11]　XUXiang2rong,WANGWen2hua,LIHua2bin(徐向荣,王文华,李华斌).ProgressinBiochemistryandBiophysics(生物化学与生物物

理学进展),1999,26(1):67.

[12]　GlebskaJ,KoppenolWH.FreeRadica.Biol.Med.,2005,38:1014.[13]　BielskiBHJ,ShiueGG,BajukS.JournalofPhys.Chem.,1980,84:830.

[14]　KoppenolWH,VanBuurenKJH,ButlerJ,etal.Biochim.Biophys.Acta,1976,449:157.[15]　LinJM,YamadaM.Anal.Chem.,1999,71:1760.

[16]　SutherlanMW,LearmonthBA.FreeRad.Res.,1997,27:283.

[17]　TIANYi2ling,CHENGuan2hua,CUITong(田益玲,陈冠华,崔　同).SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析),2005,

25(4):617.

1098光谱学与光谱分析　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第29卷

[18]　MarklundS,MarklundG.EuropeanJournalofBiochem.,1974,47:469.

[19]　PANGZhan2jun,ZHOUMei,CHENYuan(庞战军,周　玫,陈　瑗).MedicalResearchMethodsofFreeRadical(自由基医学研究方

法).Beijing:People’sMedicalPublishingHouse(北京:人民卫生出版社),2000.112.

[20]　MisraHP,FridovichI.JournalofBiol.Chem.,1972,247(10):3170.

[21]　FANGGuang2rong,LIULi2ming,LILing,etal(方光荣,刘立明,李　玲,等).JournalofAnalyticalScience(分析科学学报),2004,

20(1):60.

[22]　LIANGAi2hui,JIANGZhi2liang,ZHOUSu2mei,etal(梁爱惠,蒋治良,周苏梅,等).SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光

谱分析),2006,26(11):2113.

[23]　RENFeng2lian,WUNan,SIShi2hui(任凤莲,吴　南,司士辉).ChineseJournalofAnalyticalChemistry(分析化学研究简报),2001,

29(1):60.

[24]　ZANGYun2bo,ZHANGAi2mei(臧运波,张爱梅).JournalofAnalyticalScience(分析科学学报),2005,21(1):81.

[25]　ZHANGAi2mei,ZANGYun2bo(张爱梅,臧运波).PhysicalTestingandChemicalAnalysis(PartB:ChemicalAnalysis)(理化检验2化学

分册),2006,42(6):469.

[26]　ZHANGHai2rong,WANGWen2yan(张海容,王文艳).SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析),2007,27(13):7.[27]　GUXue2xin,TAIChao,ZOUHong,etal(谷学新,邰　超,邹　洪,等).JournalofAnalyticalScience(分析科学学报),2002,18(6):

460.

[28]　HeYY,HaderDP.J.Photochem.Photobiol:Biology,2002,66:115.[29]　TangB,ZhangL,ZhangLL.Anal.Biochem.,2004,326:176.[30]　TangB,ZhangL,HuJX,etal.Anal.Chim.Acta,2004,502(1):125.[31]　GotoH,LinJM,YamadaM.Chem.Eng.(Japanese),1999,44:871.[32]　ZhaoYP,YuWL,WangDP,etal.FoodChemistry,2003,80:115.[33]　AlbrechtHO.Z.Phys.Chem.,1928,136:321.

[34]　GotoH,LinJM,YamadaM.BunsekiKagaku.Jpn.J.Anal.Chem.,1998,47(7):417.[35]　GotoH,LinJM,YamadaM.BunsekiKagaku.Jpn.J.Anal.Chem.,1999,48(10):945.[36]　HanaokaS,LinJM,YamadaM.Anal.Chim.Acta,2001,426:57.[37]　GleuK,PetschW.Angew.Chem.,1935,48:57.[38]　SugiuraS,KakoiH,InoueS,etal.YakugakuZasshi.Jpn.J.Pharm.,1970,90:441.[39]　NakanoM,SugiokaK,UshijimaY,etal.Anal.Biochem.,1986,159:363.[40]　OsmanAM,LaaneC,HilhorstR.Luminescence,2001,16(1):45.[41]　LundqvistH,DahlgrenC.FreeRadic.Biol.Med.,1996,20(6):785.[42]　KogaS,NakanoM,UeharaK.Arch.Biochem.Biophys.,1991,2:223.

[43]　FujimoriK,NakajimaH,AkutsuK,etal.J.Chem.Soc.PerkinTrans.,1993,12:2405.[44]　BoverisA,OshinoN,ChanceB.Biochem.J.,1972,128:617.[45]　ClappPA,EvansDF.Anal.Chim.Acta,1991,243:217.

[46]　ZHENGGuo2can,XIAOShang2you,MUXiao2jing,etal(郑国灿,肖尚友,穆小静,等).GuangzhouChemistry(广州化学),2006,31

(3):37.

[47]　LiY,WangQ,GuoJL,etal.MaterialsScienceandEngineeringC2BiomimeticandSupramolecularSystems,1999,10:25.[48]　KohnoM,MizutaY,KusaiM,etal.Bull.Chem.Soc.Jpn.,1994,67:1085.[49]　HojoY,OkadoA,etal.Biol.TraceElem.Res.,2000,76(1):75.

[50]　RoubaudV,SankarapandiS,KuppusamyP,etal.Anal.Biochem,1997,247:404.[51]　RhodesCJ,TranTT,MorrisH.Spectrochim.ActaPartA,2004,60:1401.[52]　TakeshitaK,FujiiK,AnzaiK,etal.FreeRadica.Biol.Med.,2004,36(9):1134.[53]　QianSY,KadiiskaMB,QiongG,etal.FreeRadica.Biol.Med.,2005,38:125.[]　KuppusamyP,WangP,ZweierJL.Biochemistry,1996,35(22):7051.

[55]　Shin2ichiI,SeijiM,HidekatsuY,etal.Magn.Reson.Imag.,1992,10(1):109.[56]　TogashiH,ShinzawaH,OgataT,etal.FreeRadic.Biol.Med.,1998,25(1):1.

[57]　MasumizuT,FujiiK,KohnoM,etal.BiochemistryandMolecularBiologyInternational,1998,46(4):707.[58]　PanagiotelisI,NicholsonI,FosterMA,etal.MagneticResonanceinMedicine,2001,46(6):1223.

第4期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析1099

AdvancesinDeterminationofHydroxylandSuperoxideRadicals

ZHANGHao,RENFa2zheng3

LaboratoryofFunctionalDairy,MinistryofEducationandBeijingCity,CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing　100083,China

Abstract　Metabolismisessentialforthesurvivalofcellswiththeproductionoffreeradicals.Thereisincreasingevidencefortheinvolvementofsuchspeciesinavarietyofnormalinvivoregulatorysystems.Whenanexcessoffreeradicalsisformed,theycausedestructiveandlethalcellulareffectsbyoxidizingmembranelipids,cellularproteins,DNAandenzymes.Inaddition,ithasbeenrecognizedthatoxidativestressplaysasignificantroleinanumberofdiseases.Forexample,manystudieshaveshownincreasedoxidativedamagetoallthemajorclassesofbiomoleculesinthebrainsofAlzheimer’spatients.Furthermore,cancerisprobablyaconsequenceofoxidativeDNAdamage.Therefore,thedeterminationmethodsoffreeradicalareveryimportantandnecessary.Thedevelopmentofdeterminationtechniquesofhydroxylandsuperoxideradicalswasreviewedwith62referencesinthepresentpaper,thetechniquesofdeterminationmainlyincludespectrophotometry,fluorophotometry,chemiluminescence,andelectronspinresonance,andtheiradvantagesanddisadvantageswereevaluated.Keywords　Hydroxylradical;Superoxideradical;Determinationtechniques;Review

(ReceivedNov.28,2007;acceptedMar.6,2008)　　

3Correspondingauthor

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