时珍国医国药2010年第21卷第11期LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL.21 NO.11 牡蛎肽肠内营养制剂对小鼠免疫功能的影响 蔡冰娜 , ,吴园涛 ,孙恢礼 (1.中国科学院南海海洋研究所,广东广州510301: 2.中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室,广东广州510301; 3.中国科学院研究生院,北京100049) 摘要:目的研究牡蛎肽肠内营养制剂对小鼠免疫功能的影响、方法以牡蛎肽为蛋白源,研制获得牡蛎肽肠内营养制 剂,检测血液生化指标和脏器系数进行营养评定,采用小鼠脾淋巴细胞转化试验、碳粒廓清试验、乳酸脱氢酶测定法研究 了其对免疫功能的影响。结果牡蛎肽肠内营养制剂可以维持小鼠正常生理生化功能,能明显增强小鼠的细胞免疫和 NK细胞活性,低剂量组能增强小鼠的巨噬细胞吞噬功能 结论牡蛎肽肠内营养制剂对小鼠具有提高机体免疫的作用, 可以作为肠内营养制剂应用于临床营养支持: 关键词:牡蛎肽肠内营养制剂; 细胞免疫; 单核一巨噬细胞; NK细胞 DOI标识:d0i:10.3969/i.issn.1008_()805.2010.11.043 中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1008—0805(2010)ll一28164)2 Effect of Oyster Peptide—based Internal Nutrition on Immune Function of Mice CAI Bing.na , 一.WU Yuan-ta0 , .SUN Hui 1i ’!’ (1.South China Sea Institute of Oceanology,CAS,Guangzhou 510301,China;2.Key Laboratory of Marine Bio—resourses Sustainable Utilization,South China Sea Institute of Oceanology,CAS,Guangzhou,510301, China;3.Graduate School of Chinese Academy of Sciences,Beijing 1 00049,China) Abstract:Objective To investigate the effect of oyster peptide—based intenal nutrition on imnmnological function in mice. Methods Oyster peptide——based internal nutrition was prepared from oyster peptide as protein resources.The nutritional status in mice was measured by blood parameters and organ coeficifent.By lymphocyte transformation test,carbon particle clearance test and lactate dehydrogenase mensuration,the effect of oyster peptide—based internal nutrition on immunity was evaluated.Results The preparation could maintain normal physiological functions of mice and enhance cellnar immunity and NK cell activity.The low dose group could stimulate macrophage funnction.Conclusion Oyster peptide—based nutrition can play a signiicantf role in en— hancing immunity of mice.The results indicate that the preparation can be used as a kind of interal nutrition in clinical nutrition support. Key words:Oyster Peptide—based Enteral Nutirtion;Celluar Inmmnity;Monocyte—macrophages;NK Cell 21世纪是海洋的世纪,开发海洋生物资源,向海洋索取食 牡蛎味道鲜美,营养价值丰富,历来受世人推崇。运用现代 药品已经成为海洋生物资源可持续发展利用的重要内容。 。 食品工业发酵、酶解等技术手段得到的牡蛎提取物,含有大量的 品、功能性短肽和多肽、氨基酸等营养成分,具有提高免疫、抗氧 海洋生物活性物质例如蛋白质、多糖、多肽、维生素、矿物质的研 化 等多种生理功能,已被广泛地应用于功能食品、营养食品、 究已经取得了巨大进展 ’,但国内外对海洋生物活性物质在营 保健医药等领域_。肠内营养制剂指应用于临床肠内营养支持 养支持领域研究尚未见报道:因此,以海洋生物活性物质为肠内 研制新型临床肠内制剂,成为肠内营养支持领 的各种产品的统称,其原材料主要来源于陆地动植物提取物。肠 营养制剂营养源, 内营养支持已经成为我国临床营养支持中重要的组成部分,大量 域一个重要的研究内容。肠内营养制剂多用于手术病人、危重病人、昏迷病人及不能 的陆源肠内营养制剂已经上市,得到了市场的初步认可 。近 各种情况下的营养不良等病人的营养支持,机体 年来禽流感、口蹄疫等禽畜类传染病的频发,使得陆源禽畜类传 经口进食病人、统食品原料存在着极大的安全隐患,加之陆源原料存在氨基酸价 免疫力低下是临床病人的普遍症状,容易导致各种术后并发 不高、功能成分有限等缺点,很难达到肠内营养制剂的要求。 收稿日期:2010-02-04;修订日期:20104)6-27 症 。因此,肠内营养制剂对机体免疫功能的影响,是判断肠内 营养制剂临床应用效果的重要评价指标。本文研究本实验室自 行研制的牡蛎肽肠内营养制剂(Oyster Peptide—based Enteral Nu— 基金项目:国家科技支撑项目(No.2008BAD94B08); 作者简介:蔡冰娜(1984-),女(汉族),广东汕头人,现任中国科学院海洋 型临床肠内营养制剂研究工作. 通讯作者简介:孙恢礼(1955一),男(汉族),海南乐东人,现任中国科学 trition.以下简称OPEN)对小鼠免疫功能的影响。该制剂以牡蛎 国家“863”计划资助项目(No.2007AA091602); 肽为蛋白源,玉米油和鱼油为脂肪源,麦芽糊精为主要碳水化合 中国科学院知识创新工程重要方向创新项目(No.KZCX2一Yw 物来源,海水螺旋藻和果蔬粉为维生素和矿物质来源,混合研制 209); 得到。初步研究表明,牡蛎肽肠内营养制剂能提高机体免疫力, 粤港关键领域重点突破项目(No 200749861 1) 可以作为肠内营养制剂应用于临床营养支持,为新型肠内营养制 一生物资源可持续利用重点实验室研究助理,硕士学位,主要从事海洋生物 剂的研制提供了重要的理论参考。 1材料 院南海海洋研究所研究员,博士研究生导师,学士学位,主要从事海洋生 物资源高值化利用与绿色技术研究工作 ・牡蛎肽肠内营养制剂为本实验室自行研制提供。 SPF级BALB/C小鼠,雄性,体质量18~22 g,购自广东省医 学实验动物中心,许可证号SCKK(粤)2008-0002。按每组lO只 2816・ LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL.21 NO.11 时珍国医国药2010年第21卷第11期 随机分为5组。其中模型组,灌胃环磷酰胺20 rag/kg;阳性对照 量组的吞噬指数均有所提高,其中低剂量组吞噬指数有明显的增 组,灌胃百普素(Pepti一2000);实验组分为低剂量组(0.04 g/g‘ 高(P<0.05),中剂量组和高剂量组有增高的趋势,但无显著性差 bw)、中剂量组(0.08 g/g・bw)和高剂量组(0.16 g/g‘bw),灌胃 异(P>0.05),效果不如低剂量组:说明OPEN低剂量组能增强小 OPEN:除空白组外,其余组动物均每天腹腔注射环磷酰胺20 鼠巨噬颗粒异物的能力。由此推断,OPEN可能具有促进单核一 mg/ml,同时灌胃给予营养液0.2 ml/10 g,连续给予15 d。 巨噬细胞吞噬功能的作用,增强机体的非特异性免疫功能。 2方法 2.1 血液生化指标检测和脏器系数各组给予营养液期间,每周 测量体质量两次,每天进行日常观察1次。两周后脱颈处死,眼 眶取血,计算脾脏、胸腺的脏器指数,测定总蛋白、白蛋白含量,进 行营养评定。 2.2细胞免疫:小鼠脾淋巴细胞转化实验参照卫生部《保健食 品检验与评价规范》(2003年版)的方法。 2.3单核一巨噬细胞功能:小鼠碳粒廓清实验参照卫生部《保 健食品检验与评价规范》(2003年版)的方法。 2.4 NK细胞活性:乳酸脱氢酶测定法参照卫生部《保健食品 检验与评价规范》(2003年版)的方法。 图1 OPEN对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影晌(%,i±s 3结果与讨论 3.1 血液生化指标和脏器系数结果OPEN制剂对免疫抑制小 鼠的血液生化指标及脏器系数的影响结果见表1:与模型组相 比,OPEN各剂量组总蛋白和白蛋白的含量均有所增加,其中中 剂量组白蛋白和总蛋白具有显著性差异(P<0.05),低剂量组总 蛋白和高剂量组白蛋白增加具有显著性意义(P<0.05);OPEN 各剂量组胸腺、脾脏和体重比值无显著性差异(P>0.05)。与阳 性对照组比较,OPEN各剂量组的胸腺和脾脏体重比以及各项血 籁吕{ 临 7 6 5 4 3 2 1 0 液生化指标均没有显著性差异(P>0.05)。 ∞∞ ∞∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 缎别 营养不良或因消耗性疾病等原因会导致机体蛋白质丢失,导 图2 OPEN对小鼠单核一巨噬细胞功能的影响(10~,i±s) 致总蛋白、白蛋白等下降,因此,衡量食物对总蛋白和白蛋白的影 响,是评价食物改善营养不良状况的重要指标 实验结果表明, 3.4 NK细胞活性实验结果本实验通过乳酸脱氢酶法来测定免 OPEN可提高免疫抑制小鼠的白蛋白和总蛋白含量,对胸腺、脾 疫低下小鼠的NK细胞活性。活细胞的胞浆内含LDH,正常情况 脏和体重比值没有明显影响,OPEN可以维持小鼠的正常生理生 下,LDH不能透过细胞膜,当细胞受到NK细胞的杀伤后,LDH 化功能,改善机体营养不良的状况。 释放到细胞外,通过光密度值反应NK细胞的杀伤活性。结果见 图3。由结果可知,与模型组比较,各剂量组NK细胞活性有所增 表1 OPEN对小鼠血液生化指标和脏体比的影响(i± ) 加,其中低、中剂量组具有显著性意义(P<0.05)。由此可见, OPEN具有增强小鼠NK细胞活性的作用,可以增强小鼠的非特 异 『生免.疫能力 与模型组相比较, Jp<0.05 3.2细胞免疫结果用环磷酰胺造成免疫功能低下小鼠模型,通 过灌胃OPEN观察其对免疫功能低下小鼠淋巴细胞增殖反应的 影响。当T细胞受ConA刺激后母细胞发生转换,活细胞尤其是 增殖的细胞通过线粒体水解酶将M,ITr分解为蓝紫色结晶而显 色。光密度值能反映T细胞的增殖情况,体现了T淋巴细胞转化 组别 为T淋巴母细胞的能力。 图3 OPEN对小鼠NK细胞活性的影响(%。x± ) 小鼠脾淋细胞在ConA刺激下的增殖百分率见图1。由结果 4结论 可知,与模型组比较,各剂量组的脾淋巴细胞增殖率均有所增加, 自20世纪70年代临床营养支持由黎介寿等引入我国以来, 其中低、高剂量组脾淋巴细胞增殖率明显增高(P<0.05),说明 肠内营养支持逐渐被我国临床医学家所接受,成为“肠道有功能 OPEN能对抗环磷酰胺所致的免疫低下小鼠脾脏T淋巴细胞增 且能安全使用”时的首选。随着肠内营养研究的不断进展,术后 殖的下降。表明OPEN能有效促进T淋巴细胞转化为T淋巴母 早期肠内营养支持能减少并发症,增强免疫促进恢复,提高病人 细胞的作用,能明显增强机体的细胞免疫活性,改善机体免疫机 对综合治疗的耐受性已渐成共识 。临床观察显示消化道肿 能受抑状态,增强机体的特异性免疫功能。 瘤术后早期应用百普素行肠内营养治疗,能改善营养状况及提高 3.3 单核一巨噬细胞结果通过小鼠碳粒廓清实验,当碳颗粒进 机体免疫功能 。目前,国内市场上主要的肠内营养制剂产品 入血液后,血液中的吞噬细胞一单核细胞即吞噬异物颗粒。在一 大部分依靠进口,价格昂贵,了肠内营养制剂在临床上的应 定范围内,吞噬速率与血中碳颗粒浓度成正比,而与已吞噬的碳颗 用。同时,上市的肠内营养制剂产品主要营养物质来源于陆地动 粒量成反比。吞噬指数是反映了巨噬细胞的吞噬能力,体现了其 植物,资源丰富且具有多种生理活性的海洋生物原材料没有得到 非特异性免疫能力的强弱。由图2结果可知,与模型组比较,各剂 广泛的应用 ・2817・ 时珍国医国药2010年第21卷第11期LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MED1CA RESEARCH 2010 VOL.21 NO.11 本文针对上述问题,研制获得牡蛎肽肠内营养制剂,观察其 [J].肠外与肠内营养,14(5):301. s D.Ga ̄side DF.Challenges for economic policy in sustainable 对免疫低下小鼠的免疫功能影响。结果表明,牡蛎肽肠内营养制 [4] Davi剂可以维持小鼠的正常生理生化功能,改善机体营养不良状况。 并能明显增强小鼠机体的细胞免疫活性和NK细胞的活性,改善 机体免疫机能受抑状态,同时增强机体的特异性免疫和非特异性 免疫功能。从而缓解临床病人表现出的营养不良和免疫力低下 management of marine natural resoHrces[J].Ecological Economics, 2001,69:289. Michael A,Borowitzka.Microalgae as sources of pharmaceuticals and other biologically active compounds[J]Journal of Applied Phycology, 1995,7(1):3. 的主要症状,减少病人的并发症,促进机体康复。初步研究推断, r ] Barbara E.Wildhaber,HHa Yang,Ariel U,et a1.Lack of enteral nutri. 牡蛎肽肠内营养制剂可以作为肠内营养制剂应用于临床营养支 tion—effects Oil the intestinal immune system[J].Journal of Surgical 持。关于牡蛎肽肠内营养制剂对临床病人的应用效果,需要进一 Research.2005,123(1):8. 步开展人群试食实验加以验证。 『7 1 Laura Harkness.The history of enterl nutaitrion therapy:from raw eggs 参考文献: and nasl taubes tu puriifed amino acids and early postoperative jejunal delivery[J].Journal of the American Dietetic Association,2002,102 [1]雷丹青,周先果,张辉,等.牡蛎酶解液的抗氧化活性研究『J1.时 (3):399. 珍国医国药,2008,19(11):2674. [2]Mingyong Zeng,Wenxuan Cui,Yuanhui Zhao,et a1.Antivim1 active[8] 黎介寿.肠内营养一外科临床营养支持的首选途径[J].肠外与肠 内营养,2003,10(3):129. peptide from oyster[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2008.26(3):307. 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Key words:Ultraviolet Absorption Spectum;r Benzoinum; Qualitative distinguish 越来越广泛地应用于中药材的鉴别研究,常用方法 安息香为安息香科植物白花树Styrax tonkinensis(Pierre) 准确等特点,Craib ex Hart.的干燥树脂 J,树干经自然损伤或于夏、秋二季割 有单一紫外光谱法和紫外光谱组法 j。在此基础上,本研究采 裂树干,收集流出的树脂,阴干 ,是中医常用的开窍药,始载于 用系统溶剂对药材进行提取,对安息香的石油醚(60~90%)、乙 《唐本草》;李时珍谓:“此香辟恶,安息诸邪,故名” 。《中国药 醚、正丁醇3个提取部位及甲醇提取液进行紫外扫描,以谱线组 典》1953年开始收载至今。其性味辛、苦、温,人心、脾、肺、胃经, 的特征吸收峰(谷)数及其峰位值为依据 ,用整体与分部位相 具有开窍辟秽、行气活血、镇咳祛痰之功 。《中国药典}2005年 结合的方法更准确、全面地反映安息香药材的内在品质。 版采用加热及5%三氯化铁乙醇溶液显色对其进行鉴别,并不能 1仪器与试药 准确地反映及鉴别安息香药材的质量及产地。 UV一8500紫外分光光度计(中国上海天美公司),分析用电 紫外光谱鉴别中药材具有特征性强、取样量小、简便、快速、 子天平(Max:210 g,d=0.1 mg;北京赛多利仪器系统有限公司)。 收稿日期:2009—12-03; 修订日期:2010-06-27 基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(No.2007CB512606) 安息香购于成都,产地分别为苏门答腊(批号:0901;0902)、 泰国(批号:0903;0904)和中国(批号:0905),经成都中医药大学 卢先明教授鉴定为安息香科植物白花树Styrax tonkinensis(Pi— 作者简介:夏厚林(1964一),男(汉族),四川大竹人,现任成都中医药大学药 erre)Craib ex Hart.的干燥树脂。 学院教授,博士学位,主要从事中药药效物质基础及质量标准研究工作. 所用试剂均为分析纯。 通讯作者简介:王建(1959一),女(汉族),重庆人,现任成都中医药大 2方法 学教授.硕士学位,从事临床中药学研究工作. ・2.1样品制备取安息香粉末2份(过筛120目),每份0.5g,一 2818・