实验室病原微生物危害评估报告

实验室病原微生物 危害评估报告

第1版

生效日期：2016年08月02日

XX市疾病预防控制中心综合实验室

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目 录

第一章 综合实验室实验活动生物危害评估报告 .......................................................................... 1 第二章 结核分枝杆菌的生物危害评估报告 .................................................................................. 7 第三章 金黄色葡萄球菌的生物危害评估报告 ............................................................................ 12 第四章 副溶血性弧菌的生物危害评估报告 ................................................................................ 15 第五章 致泻大肠埃希菌的生物危害评估报告 ............................................................................ 17 第六章 伤寒沙门氏菌的生物危害评估报告 ................................................................................ 19 第七章 志贺氏菌的生物危害评估报告 ........................................................................................ 22 第八章 蜡样芽胞杆菌的生物危害评估报告 ................................................................................ 24 第九章 单核增生李斯特菌的危害评估报告 ................................................................................ 28 第十章 流感病毒的危害评估报告 ................................................................................................ 31 第十一章 禽流感病毒的危害评估报告 ........................................................................................ 33 第十二章 肠道病毒71型的危害评估报告 .................................................................................. 36 第十三章 麻疹病毒的生物危害评估报告 .................................................................................... 39 第十四章 人类免疫缺陷病毒HIV的生物危害评估报告 ........................................................... 41 第十五章 乙型脑炎病毒的生物危害评估报告 ............................................................................ 43

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第一章 综合实验室实验活动生物危害评估报告

为保证实验室工作人员在工作中不被危害性生物及物品所侵害，保证危害性物品不外泄，对实验室工作环境进行评估，以鉴定生物安全防护等级，保证生物安全。 一、危害程度分类及生物安全防护水平评估

生物源危害主要是由各种检验标本中的微生物，尤其是病原微生物引起的，包括细菌、病毒、寄生虫等，具有潜在危险性，可能引起实验室感染；微生物室还进行一定数量的各种条件致病性细菌及真菌的分离培养工作，工作过程存在病原微生物对实验人员、环境污染的风险；除之以外实验室还存在触电、火灾、化学品腐蚀、偷盗等危险。根据《实验室生物安全通用要求》，本实验室不涉及《人间传染的病原微生物名录》中高致病性微生物的分离培养及高致病性微生物的菌、毒种的保藏，实验室采用一定防护措施就能控制感染或防范灾害，或者对相应病原体存在有效的免疫方法。评估我实验室生物安全防护水平按二级实验室（BSL-2）生物安全要求。 二、实验人员和实验室安全防护的一般要求 1.吸烟危害评估及防护

（1）实验室工作区内绝对禁止吸烟； （2）点燃的香烟是易燃液体的潜在火种；

（3）香烟、雪茄或烟斗都是传染细菌和接触毒物的途径。 2. 实验区内食用食物、饮料及其它危害评估及防护

（1）实验工作区内不得有食物、饮料及存在“手－口”接触可能的其它物质

（2）实验室工作区内的冰箱禁止存放食物。专用存放食物的冰箱应放置在允许进食、喝水的休息区内。

3.使用化妆品危害评估及防护

实验工作区内禁止使用化妆品进行化妆，但允许并建议经常洗手的实验人员使用护手霜。

4. 实验中眼睛和面部的风险评估及防护

（1）处理腐蚀性或毒性物质时，须使用安全镜、面罩或其它保护眼睛和面部的防护用品。 （2）工作人员在实验室的危险区内不要佩戴眼镜，除非同时使用护目镜或面罩。 （3）使用、处理能够通过粘膜和皮肤感染的试剂，或有可能发生试剂溅溢的情况时，必须佩带护目镜、面罩或面具式呼吸器。 5. 实验中服装和个人防护装备的一般要求

（1）应穿着符合实验室工作需要的服装，工作服应干净、整洁。当工作中有危险物喷溅到身上的可能时，应使用一次性塑料围裙或防渗外罩。有时还需要佩戴其它防护装备如：手套、护目镜、披肩或面罩等。

（2）采血员和其他需要接触病员的工作人员，在接触病员时需穿实验服或工作服。

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（3）个人防护服装应定期更换以保持清洁，遇被危险物品严重污染，则应立即更换。 （4）不得在实验室内设值班床，严禁在实验室内住宿。 6. 实验中足部防护的一般要求

在工作区内，应穿舒适、防滑、并能保护整个脚面的鞋。在有可能发生液体溅溢的工作岗位，可加套一次性防渗漏鞋套。帆布鞋可吸收化学物品和有传染性的液体，所以最好穿皮革或其它防渗漏的合成材料的鞋。 7. 实验中头发和饰物的风险评估及防护

留长发的工作人员应将头发盘在脑后，以防止头发接触到被污染物和避免人体脱屑落入工作区。头发不得垂肩，应与离心机、切片机等正在运转的器械保持一定距离 8. 实验中胡须的风险评估及防护

蓄有胡须的男性工作人员必须遵守上项（7）的规定。 9.洗手的要求

实验室工作人员在脱下手套后、离开实验室前、接触患者前后、以及在进食或吸烟前都应该洗手。接触血液、体液或其它污染物时，应立即洗手。 10.用口移液的危害评估及防护

用口液移可导致多种病原体的实验室感染。

所有实验室操作禁止用口液移，应使用助吸器具。 11.锐利物品的危害评估及防护

谨慎处理针头、解剖刀、和碎玻璃等锐利物品。使用后的针具不要折断、弯曲、破损、重复使用或用手重装在针管上。一次性注射器上的针头用后不要取下。锐利物品应立即放置在专用锐器盒内，在完全装满之前或48小时之内更换。 12.隔离措施的要求

接触患者时，实验室工作人员应遵守医院的隔离措施。 13.工作环境的要求

（1）“清洁”区和“非清洁”区

根据实验室的具体工作情况由主任选择并确定“清洁”和“非清洁”工作区，在清洁区和非清洁区之间设“缓冲室”。被指定为“清洁”的区域，则应努力保持清洁，如采取预防措施，防止电话、视频显示器终端、键盘、门柄及其它经常被手或手上的手套触摸的物品的污染，要求工作人员在触摸设备（如计算机键盘及电话的保护罩等）前取下手套，制定仪器设备和工作面的常规消毒和清洁制度和对严重污染的紧急处理措施办法。

被指定为“非清洁”的区域，允许戴手套接触所有物品（如电话、门柄、计算机终端和其它物品），所有这些物品的表面都认为是不清洁的。未戴手套的人员如果使用该区域内的电话、计算机终端或其它设备，应该戴上手套，或在使用后立即彻底洗手。

“清洁”和“非清洁”区都应保持整洁。实验台至少应每天清洁、消毒一次，如有必要可以多次清洗、消毒。在处理溅溢的样品或严重污染的工作面时，应戴上手套和其它个人防护装备、使用相应合适的清洁剂清除所有的溅溢物。

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（2）冰箱、冷冻柜、水浴和离心机应该定期清洗和消毒（时间由实验室主任来决定），在发生严重污染后应立即进行清洗和消毒。进行清洗、消毒时要戴上手套，穿上工作服或其它合适的防护服。

（3）外衣：外衣（实验服、工作服、和围裙）应悬挂在远离散热器、蒸汽管道、供暖装置、以及有明火的地方，不要挂在压缩气瓶或灭火器上，也不要挂在门的玻璃隔板上，妨碍视线。“清洁”的和“非清洁”的个人防护服要分开存放。 （4）垃圾处理：每天至少清理垃圾一次。

（5）装饰：不得在电灯、灯座或仪器上进行装饰，更不要使用电子装饰物、蜡烛、圣诞树等有引起火灾危险的装饰品。

（6）为便于清洁消毒，实验室内不应有织物装饰的用具或椅子。

（7）个人物品：实验工作区不得存放个人物品，如钱包、外套、皮靴、咖啡杯、运动服、预包装的食品和药品等。

（8）实验室内应配备应急设备，如应急洗眼装置，酒精等消毒用品。 （9）实验室应安装非手触式洗手装置。

（10）实验室内应安装防蚊蝇装置，应定期投撒灭蟑螂、老鼠的药物。

（11）用后的废弃物品：实验工作区内的用后废弃物品存量不要太大。具危险性的液体如酸或碱性液体应放在视平线以下。较大的废弃物容器应靠近地面存放。

（12）出口通路：实验室的出口和通道必须保持畅通无阻，不准堆放物品、垃圾、装置、或设备。安全门必须保持畅通，不得堵塞。

注意：无论任何时间、何种原因都不得阻塞通往灭火器、火警箱、防火毯、安全淋浴或出口的道路。

14.使用玻璃器具的危害评估及防护

操作玻璃器具时应遵循下述安全规则： （1）不使用破裂或有缺口的玻璃器具。

（2）不要用猛力取下玻璃试管上的塞子，粘紧的试管可用刀切开分离。 （3）接触过传染性物的玻璃器具，清洗之前，应先行消毒。

（4）破裂的玻璃器具和玻璃碎片应丢弃在有专门标记的、单独的、不易刺破的容器里。 （5）高热操作玻璃器具时应戴隔热手套。

（6）在不影响实验质量的前提下，应尽量减少使用玻璃器具。 15. 使用离心机的危害评估及防护 感染途径 危害评估 感染途径 危害评估 感染途径 危害评估 皮肤 极少 粘膜（眼结膜） 可能 呼吸道 可能 消化道（经手-经血（、极少 极少 经血（虫媒介） 极少 口） 切割伤） （1）气溶胶：离心过程中应控制气溶胶的产生在最低水平。 （2）操作：离心机只有在盖好盖板后，才能启动。

（3）传染性物品：所有能够产生气溶胶进行播散的生物制品或标本，都应使用密封的离心管，并在盖紧的离心头或转头中进行。

（4）为防止气溶胶飞溢，应在离心停止30分钟后打开离心物。 （5）清洗：按照消毒隔离制度要求清洗离心机。

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（6）平衡：离心时应保持合适的平衡，以保证离心的顺利进行。 16．采集血样的危害评估及防护 感染途径 危害评估 感染途径 危害评估 感染途径 危害评估 皮肤 极少 粘膜（眼结膜） 极少 呼吸道 可能 消化道（经手-经血（、极少 可能 经血（虫媒介） 极少 口） 切割伤） 盗窃 可能 化学腐蚀 极少 放射 无 （1）每天早晨用500mg/L的”84”消毒液擦拭抽血台面及其它物表，并开紫外灯消毒至少30分钟，并做好记录。

（2）工人每天早晨更换消毒液，包括浸泡锐器、止血带的消毒液和手消毒液。 （3）工作人员必须穿工作服，戴好口罩、帽子、和手套。

（4）使用合格的一次性用品。严禁使用包装破损，超过有效期的一次性用品。

（5）严格执行无菌技术操作规程、静脉采血必须一人一针一管一巾一带。微量采血应做到一人一针一管一片，对每位病人操作前洗手或手消毒。

（6）无菌物品如棉球需每天更换，开启后使用不得超过24小时。

（7）工作人员需对锐器如采血针采取高度预防措施，用过的采血针需浸泡在含有消毒液的厚壁容器中。

17. 标本(血清、血浆、全血、尿)上检验分析仪检测过程的危害评估及防护 感染途径 危害评估 感染途径 危害评估 感染途径 危害评估 皮肤 极少 粘膜（眼结膜） 可能 呼吸道 可能 消化道（经手-经血（、极少 极少 经血（虫媒介） 极少 口） 切割伤） 盗窃 可能 化学腐蚀 无 放射 无 （1）为了避免液滴和气溶胶和扩散，实验室仪器加样、加液，清洗等过程应在封闭罩内进行的。

（2）实验中使后的比色盘，反应杯等废弃物应当收集在封闭的容器内，集中处置。 （3）在每一步完成后应根据操作指南对对仪器进行消毒。血液、体液污染物表时，应立即消毒。

（4）工作人员要戴手套进行操作。

18. 标本(血清、血浆、全血、尿、粪)手工检测过程的危害评估及防护 感染途径 皮肤 消化道（经手-口） 盗窃 危害评估 可能 可能 可能 感染途径 危害评估 感染途径 粘膜（眼结膜） 可能 呼吸道 经血（、可能 经血（虫媒介） 切割伤） 化学腐蚀 可能 放射 4

危害评估 可能 极少 无 综合实验室质量管理体系文件

（1）每天早晨做好实验室的清洁消毒工作。 （2）工作人员要戴口罩、手套进行操作。

（3）实验中使用的竹签用后要用1000mg/L“84”消毒液浸泡。

（4）废弃的标本连同试管、盖帽要用1000mg /L“84”消毒液浸泡，由工人统一清洁后进行无害化处理。

（5）实验中使用的吸头、一次性塑料杯用后要用1000mg/L“84”消毒液浸泡。 （6）标本污染物表时，应立即消毒。

（7）离心时，发生试管破裂或标本溅出，由操作者负责用有效消毒剂对离心机内部进行及时消毒处置。

19．微生物分离鉴定药敏试验及基因扩增试验活动的危害评估及防护 感染途径 危害评估 感染途径 危害评估 感染途径 危害评估 皮肤 可能 粘膜（眼结膜） 可能 呼吸道 可能 消化道（经手-经血（、可能 可能 经血（虫媒介） 可能 口） 切割伤） 盗窃 可能 化学腐蚀 极少 放射 无 （1）每天早晨开紫外灯消毒空气至少30分钟，同时做好各物表、仪器的清洁消毒工作。 （2）实验人员要戴手套、帽子进行操作。当估计会出现微生物和危险物溅出时要戴好眼罩或面罩。

（3）操作中使用的接种环、镊子等金属物品要在酒精灯火焰上烧灼灭菌。

（4）可能产生致病性微生物气溶胶或出现溅出的操作如涂片、接种时，应在生物安全柜内操作，并使用个体防护设备。

（5）实验室内的各种标本、菌种、培养基和其它废弃物在运出实验室前必须灭活（高压、浸泡），需运出实验室灭活的物品必须放在专用的密闭容器中。

（6）操作过程中发生菌种污染物表时，应马上采取措施进行物表消毒。

（7）当发生致病性微生物气溶胶污染时，应马上进行人员疏散，通知负责人到现场进行指导消毒。

（8）对菌种的保存应严格遵守菌种保存制度，严禁擅自保存各种国家法定传染病菌株或毒株。

（9）实验人员离开实验室前要去除手套，确认无污染或污染已排除，后方可洗手离去。 （10）微生物、PCR实验室要设置纱窗、挡鼠板。 三、特定实验活动危害评估

见以下章节之各种病原体的危害评估 四、工作人员素质

本实验室共有技术人员10名，其中申请进入BSL-2实验室10名。硕士学位3名，5名曾经从事微生物学实验，5名曾经从事无菌实验室活动经历，10名技术人员学习过生物安全手册并通过定期培训及考核成绩合格，经体检无现患严重疾病，本实验室无其他患传染性疾病的技术人员，健康状态良好。

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五、评估结论

本次评估本实验室共14项可能潜在危险的实验活动，在实验操作实验施过程中在无控制措施情况下可能产生的高危害度2项，中度12项，低度0项；对危害发生的可能性分析，实验危害较大可能发生的有0项，可能发生2项，较少可能发生12项；这些危害造成高度严重后果的2项，后果严重性中度的12项，后果严重性低度的0项。根据拟采取的预防控制措施后依然存在的残留风险为高度0项，中度0项，低度危害12项。

评 估：评估人：审 核：审核人：

XX市疾病预防控制中心综合实验室

XX市疾病预防控制中心生物安全管理委员会

2016年8月02日

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第二章 结核分枝杆菌的生物危害评估报告

结核病是由结核分枝杆菌（偶尔可由牛型或非洲型分枝杆菌）引起的一种细菌性疾病。结核病可累及全身各个器官，但以肺结核最为常见。该病具有传染性强，散播面广，不分地域均可发生。结核病可由呼吸道、消化道、皮肤等途径感染，但其主要传播途径是以空气为传播因子的呼吸道传染，而排菌的肺结核病人传染性更大，是传播感染的主要传染源。 1. 传播途径

呼吸道感染（respirator tract infection）是肺结核的主要传染途径（routes of infection），飞沬传染（droplet infection）为最常见的方式。传染源主要是排菌的肺结核患者（尤其是痰涂片阳性未经治疗者）。飞沬核（droplet nuclei）＜ 10μm时可被吸人呼吸道，健康人可因吸入患者咳嗽、打喷嚏时喷出的带菌飞沫而受感染。

2. 危害程度分级

微生物按其是否致病、致病力强弱、危害人体的严重性、传染性的大小、临近人群的抵抗力、有无免疫制剂和特效治疗药物等综合评价，可分为四个不同的危害等级。结核分枝杆菌属于3级危险。

3级危险（对个体具有极大危害，对群体具有较大的危害性）：指有特殊危险的致病菌。感染后症状较重，并可能危及生命，或者缺乏有效的预防方法、发病后不易治疗的微生物。 3. 实验室感染的原因及预防

（一）技术操作可能导致的感染及其预防措施。

1. 接种：应使用无弹力的铂丝接种环，结核菌接种后接种环火焰灭菌易崩散，酒精灯烧灼时要特别注意。

2. 混匀：吸管吸吹菌液时不要产生气泡，应沿容器壁排出。 3. 研磨：最好使用组织研磨器，乳钵易产生气溶胶。

4. 移液：吸管上端的棉花松紧要适度，吸液时要从管底吸取，吹出时要轻缓，不要全部吹净，以免产生气泡，形成气溶胶。

5. 开封：要避免压力和气流的急剧变化。

6. 离心：离心管套底垫要完好，使用匹配的管、套、离心头，加盖。 7. 注射：做好个人防护，正确使用注射器。

8. 搬运：室内移动要避免滑落，移出室外要有坚实密闭的外包装。 （二）技术保障

1. 双人原则，不允许单人操作1、2类病原。

2. 入口处应有危险警示标识，并标明所操作的微生物的种类。

3. 培训考核上岗，掌握相关技术操作要领，熟悉规章制度，适应工作环境。 4. 完备的管理措施，技术操作规范。

5. 良好的工作行为可降低生物危害风险。

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4. 实验室中的分枝杆菌及分枝杆菌气溶胶

结核病实验室工作人员，在分枝杆菌检验过程中，会接触到各种潜在感染源标本和各种危险物，特别是许多操作易产生分枝杆菌气溶胶。含有结核分枝杆菌的微滴核（1-5微米）通过呼吸进入人体肺泡，可以黏附在肺泡内生长繁殖。因此，首先要对实验室中生物危险物产生的途径和存在的地点有充分的认识，以便明确生物安全防护的环节。

(一) 分枝杆菌存在的地点

1、各种临床标本，通常是痰，胃或支气管灌洗液、脑脊液、尿液等。 2、被污染的操作台、器械、仪器、试剂等。

3、收集的结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌菌株等。 4、细菌学实验室的部分区域。 (二) 产生分枝杆菌气溶胶

1、实验室内可疑肺结核患者痰标本的采集。 2、样本的制备和涂片的火焰固定。 3、分离培养或接种培养物。 4、用火焰烧灼接种环。 5、使用移液器混合培养物。

6、培养管或培养瓶中含有培养物的滴落物。 7、溢出的分枝杆菌悬浮液。

8、高速混合含有分枝杆菌的液体。

9、转移液态培养物和上清液，或培养液、上清液的倾倒。 10、离心过程中离心管的破碎。 11、用做原代培养所需的组织匀浆。 5. 安全防护

(一) 严格遵守实验室安全操作规程，任何时侯都要警惕分枝杆菌气溶胶的产生。实验室的技术人员必须经过生物安全培训后方可上岗。

(二) 实验室应严格非实验人员进入，减少实验室内外交叉生物污染。完成实验工作离开实验室，要关好门窗。

(三) 进入实验室应避免携带非必需物品。

(四) 进入实验室，工作人员应穿着工作服，操作时应穿戴防护隔离衣、口罩、帽子和手套，长发者应将头发装束在帽子内。

(五) 实验过程中绝对禁止吸烟、饮食等，不要以手抚头面部等。

(六) 试验前须开启紫外线灯对实验室和操作区域进行照射消毒1小时以上；试验结束后，立即开启紫外灯进行照射消毒2小时以上。

(七) 任何试验的开始和结束后，操作人员要用70%酒精浸泡双手或仔细擦后，用清洁剂或清水洗净。

(八) 每次试验结束后，必须清理好实验台，并用70%酒精液或3-5%石炭酸擦洗实验台面。

(九) 实验室中的生物危险品要根据检查项目和性质不同，局限在相应的试验区间，不得随意将其带到其它的实验室。

(十) 实验室内任何微生物的样本，废弃物都必须经高温高压灭菌后，方可按一般垃圾处理。

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6. 安全保障

(一) 首先各级实验室应按等级要求完善实验设施，如简易安全柜内的抽气排风功能、紫外灯消毒功能，生物安全柜维护与除菌滤膜定期更换等。

(二) 实验室采集病人痰标本时应在户外进行，避免因病人咳漱造成室内气溶胶污染。

(三) 普通实验室应注意气流方向，实验过程中尽量避免强气流变化而产生气溶胶（如﹕涂片、染色过程中）。

(四) 细菌的分离培养、菌种开封、转种、研磨、稀释等操作，各级实验室均应在简易安全柜或生物安全柜中进行。

(五) 使用接种环进行操作时，接种环应在工作灯的内焰中燃烧，以避免菌液或菌块飞溅。

(六) 稀释菌液时，吸管、针管要缓慢插入试管或烧瓶底部，小心操作避免产生气泡或气溶胶。

(七) 使用注射器加样时，用过的针头切勿再重新入套或拔开注射器与针头，应直接放入锐器收集器，以免划破皮肤造成接种感染。

(八) 菌株库要设专人管理，并按照国家微生物菌毒种管理办法执行。

(九) 进行毒菌操作过程中，不要穿戴巳经污染的防护性手套触摸门柄、仪器或毒菌区以外区域，避免由于粗心扩大污染范围。

(十) 试验结束后，操作过程中所有可能与生物危险物接触或被污染的试验器械和物品，能够高压消毒的必须高压消毒，不能进行高压消毒的设备、仪器，应使用有效的消毒剂擦洗后再以紫外灯近距离长时间消毒。

(十一) 实验中发生意外污染情况，应立即通知主管人员并做好处理污染物和相应区域的准备，不得擅自采用其它禁止的方法进行消毒处理。

(十二) 实验室主任应制定规章和程序，只有告知潜在风险并符合进入实验室特殊要求(如，经过免疫接种)的人，才能进入实验室。

(十三) 操作致病性微生物时，实验室入口处应贴有生物危险标志，并显示以下信息：有关病原、生物安全级别、免疫接种要求、研究人员姓名、电话号码、在实验室中必须佩带的个人防护设施、出实验室所要求的程序。

(十四) 实验室主任为实验室人员特别制定的标准操作程序或生物安全手册中，应包括生物安全程序。对于有特殊风险的人员，要求阅读并在工作及程序上遵照执行。

(十五) 实验室主任保证实验及其辅助人员接受适当的培训，包括和工作有关的可能存在的风险、防止暴露的必要措施和暴露评估程序。

(十六) 实验室所用任何个人防护装备应符合国家有关标准的要求。实验室应确保具备足够的有适当防护水平的清洁防护服供使用。还应穿戴其它的个人防护装备，如手套、防护镜、面具、头部面部保护罩等。

(十七) 处理样本的过程中易产生高危害气溶胶时，要求同时使用适当的个人防护装备、生物安全柜和/或其它物理防护设备。如可产生含生物因子的气溶胶，应在适当的生物安全柜中操作。

(十八) 实验用鞋应舒适，鞋底防滑。应用皮制或合成材料的不渗液体的鞋类。在从事可能出现漏出的工作时可穿一次性防水鞋套。在实验室的特殊区域（例如有防静电要求的区域）或BSL-3和BSL-4实验室要求使用专用鞋（例如一次性或橡胶靴子）。

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7. 结核病实验室废物处理

一、实验室废弃物处理的目的：

(一) 将操作、收集、运输、处理及处置废弃物的危险减至最小； (二) 将实验室废弃物对环境的有害作用减至最小。 二、实验室污物处理及消毒

(一) 实验室含有生物危险物的临床标本及被污染的一次性用品，试验完成后，应在操作台或实验区域内以紫外灯近距离照射消毒 2小时以上，再经高压消毒后方可丢弃或焚烧。

(二) 可重复使用的实验用品及器材，完成实验后，应在操作台或实验区域内经紫外灯近距离照射消毒2小时以上后，再交有关人员进行高压消毒和煮沸洗刷。

(三) 实验用的试管、吸管、注射器，须装在加盖不漏的容器内，经高压灭菌后取出。

(四) 培养物或实验室垃圾，在丢弃前必须经高压消毒和紫外灯近距离长时间照射处理。不允许积存垃圾和实验室废弃物。已装满的容器应定期运走。在去污染或最终处置之前，应存放在指定的安全地方，通常在实验室区内。

(五) 实验室废弃物应置于适当的密封且防漏容器中安全运出实验室。有害气体、气溶胶、污水、废液应经适当的无害化处理后排放，应符合国家相关的要求。

(六)实验过程中，如标本或含标本的前消化处理液被打翻污染了操作台或地面，应以吸满70%酒精的卫生纸覆盖污染区，15分钟以后卫生纸方可移去。

(七) 实验室内未经消毒的污水，禁止直接排入公共排水系统，更不允许混入居民生活垃圾。 8. 意外事故的处理

(一) 如果发生意外，必须立即通知实验室主管人员，并在有关人员的指导监督下对出事现场进行处理，绝对禁止未经报告而私自对出事现场给予非规范的处理。

(二) 实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生，应立即停止实验工作进行紧急处理，更换被污染的实验服，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒或酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗。

(三) 如果发生菌液溢出，含菌种的培养管破碎等，造成中 、小面积污染，可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱脂棉围住，向纱布倾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小时以上（其间适量加溶液防止干燥），再经紫外灯近距离（1米内）照射2小时以上；被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小时以上，实验完成后再进行高压消毒处理。

(四) 如果发生气溶胶污染或大面积污染，应立即停止实验并关闭实验室，对污染区域进行紫外灯照射消毒过夜；第二天对污染区进行24小时封闭空气熏蒸消毒（乙醛消毒法﹕5ml乙醛＋2g高锰酸钾/m3空间）。

(五) 绝对禁止使用的事故处理方法﹕

1. 任何有可能造成污染面积扩大的去污方法，如使用70%乙醇或甲酚皂液擦洗被污染的区域。

2. 直接用火焰对未经任何处理的污染地面、操作台、器械等进行烧灼处理。 3. 使用消毒效果未经证实的消毒剂进行消毒。

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4. 使用低浓度的消毒剂和紫外灯进行短时间、长距离的照射。

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第三章 金黄色葡萄球菌的生物危害评估报告

1. 生物学特性

金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原盐，液化明胶。 2. 危害程度分类

根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。 3. 致病性和感染剂量

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶，有报道目前出现越来越多的耐药菌株，MRSA即耐甲氧西林金黄色葡萄球，菌致病性也随着变强。 4. 暴露的潜在后果

暴露后可能引起感染，菌量大时可使实验人员出现皮肤软组织感染、全身性感染、呼吸道感染、中毒、肠炎等。被感染后，成为传染源，可能对周围及环境造成污染，应及时得到治疗和控制。 5. 感染途径

通过污染食品和水源经口传播，也可通过呼吸道和接触传播。 6. 微生物在环境中的稳定性

葡萄球菌是无芽胞菌中抵抗力最强者，而干燥可达数月，加热80℃30min才被杀死。5％石炭酸，0.1％升汞10～15min死亡。1:100000～1:200000龙胆紫溶液能抑制其生长。对磺胺增效剂、青霉素、红霉素等较敏感，但耐药株逐年增多，MRSA即为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

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7. 浓度和浓缩标本的容量

一般样本检测。 8. 自然和易感人群宿主

金黄色葡萄球菌常存在于鼻咽喉、下消化道、毛发和皮肤上，在人类和普通的动物都有存在。致病性依照宿主状状，卫生情况，皮肤和黏膜有否创伤而异。当宿主免疫力下降，皮肤黏膜有创伤或卫生情况不好是易感染，特别是老人和婴儿。

9. 实验操作活动

巳有文献证明，金黄色葡萄球菌可造成实验人员化脓性和呼吸道感染，人类不是该菌在唯一传染源，在许多动物身上都存在该菌。

这种病原体可以存在于受感染的人或动物的脓液，血液等多种体液中。通过污染食品和水源经口传播，和通过呼吸道和接触传播是该菌的主要传播方式，该菌也是引起院内感染的主要细菌之一。暴露在气溶胶中也可能引起感染。

按照国家标准方法对样本（粪便、食品、水样）进行分离，培养，鉴定。建议采用BSL-2级水平的操作技术，防扩散设备和设施。一旦发生意外，按照本实验室的《意外事故应对方案和应急程序》进行处理。 10. 预防和治疗

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

目前疫苗还不可用于人类。该菌能对人体多部位的感染，所以跟据所致疾病的不同也应采取不同的治疗方案，主要是对症处理和针对病原治疗，大体用药可选用红霉素、新型青霉素、庆大霉素、万古霉素或先锋霉素Ⅵ治疗。

预防金黄色葡萄球菌感染，首先是要做好个人卫生，和加强餐饮和食品卫生的管理，及时发现带菌者，做好各种动物的管理工作，把能传播该菌的途径有效的控制好。 11. 工作人员素质

卫生技术专业人员，并经过生物安全培训后获得上岗证书。 12. 评估结论

该菌生物性状较稳定，但抗生素有滥用，也出现了不少的耐药株。该菌主通过污染食品和水源经口传播，也可通过呼吸道和接触传播，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。预防手段主要预防金黄色葡萄球菌感染，首先是要做好个人卫生，和加强餐饮和食品卫生的管理，及时发现带菌者，做好各种动物的管理工作，把能传播该菌的途径有效的控制好。试验过程建仪采用BSL-2级水平的操作技术、防扩散设备和设施。实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。离开实验室时，防护服必须脱下并留在实验室内。不得穿着外出，更不能携带回家。用过的工作服应先在实验室中消毒，然后统一洗涤或丢弃。 当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套。如可能发生感染性材料的溢出或溅出，宜戴两副手套。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。

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操作台面用70%酒精或含氯消毒剂擦拭，废弃物处理按本实验室废弃物处理制度进行。

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第四章 副溶血性弧菌的生物危害评估报告

副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus,VP）是一种嗜盐性细菌。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。 此菌对酸敏感，在普通食醋中5分钟即可杀死；对热的抵抗力也较弱。副溶血性弧菌食物中毒多发生在6~10月，海产品大量上市时。中毒食品主要是海产品，其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类，约有半数中毒者为食用了腌制品后。中毒原因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品被污染。。 1. PCR检测

用于检测V．p的PCR方法主要有任意引物PCR(abritrarilyprimedPCR，Ap-PCR)、针对副溶血性弧菌任意引物PCR、多重PCR(muhiplex-PCR)、实时PCR(Real-timePCR)。

实时PCR常规PCR检测，需要从反应体系中吸取产物做电泳或Southern杂交等试验进行鉴定，转移过程中易污染，造成假阳性，而且耗费时间。1996年，Tyagi开创了一种实时PCR(Real-timePCP,)。实时PCR是在，PCR反应体系中加入标记有报告基团和淬灭基团的线性Taqman。探针或茎环型荧光分子信标探针，在墓因扩增过程中，与产物杂交，此时，报告基团和淬灭基团分开，根据能量共振转移现象，报告基团发出荧光而被检测。这种方法操作简单，闭管检测，减少污染，灵敏度高，并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测，面且可以进行临床大规模快速检测。 2. 流行病学

传染源传染源为病人，集体发病时往往仅少数病情严重者住院，而多数未住院者可能成为传染源，但由于病人仅在疾病初期排菌较多，其后排菌迅速减少，故不至因病人散布病菌而造成广泛流行。

传播途径本病经食物传播，主要的食物是海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。进食肉类或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污染所引起。

地区分布特点：日本及我国沿海地区为副溶血性孤菌食物中毒发病率的高发区。据调查，我国沿海水域、海产品中副溶血性弧菌检出率较高，尤其是气温较高的夏秋季节。但近年来随着海产食品的市场流通，内地也有副溶血性弧菌食物中毒的散在发生。

季节性特点及易感性：7～9月常是副溶血性弧菌食物中毒的高发季节。男女老幼均可患病，但以青壮年为多，病后免疫力不强，可重复感染。

食物的种类：主要是海产品，其中以墨鱼、带鱼、虾、蟹最为多见，如墨鱼的带菌率达93%，其次为盐渍食品。食品中副溶血性弧菌的来源：人群

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带菌者对各种食品的直接污染。沿海地区饮食从业人员、健康人群及渔民副溶血性弧菌带菌率为11.7%左右，有肠道病史者带菌率可达31.6～88.8%。间接污染，沿海地区炊具的副溶血性弧菌带菌率为61.9%，被副溶血性弧菌污染的食物，在较高温度下存放，食用钱加热不彻底或者生吃，或熟制品受到带菌者、带菌的生食品、带菌容器及工具等的污染。 3. 治疗措施

支持及对症治疗 脱水者需输入生理盐水及葡萄盐水，或口服补液盐，以纠正失水。血压下降者，除被动补充血容量，纠正酸中毒等外，可酌用血管活性药。

抗菌药物 轻度患者可不用抗菌药物，较重者可给复方新诺明或庆大霉素、阿米卡星和诺氟沙星等喹诺酮类抗菌药物【上述抗生素类可能使细菌产生耐药性，使用须谨慎】。

发生中毒后要立即停止食用可疑中毒食品，并到医院医治。副溶血性弧菌对氯霉素敏感。呕吐、腹泻严重者要补充水和盐。 4. 中毒预防

加工海产品的案板上副溶血弧菌的检出率为87.9%。因此，对加工海产品的器具必须严格清洗、消毒。海产品一定要烧熟煮透，加工过程中生熟用具要分开。烹调和调制海产品拼盘时可加适量食醋。食品烧熟至食用的放置时间不要超过4个小时。主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏（肝、脾、肺）淤血等。

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第五章 致泻大肠埃希菌的生物危害评估报告

1. 生物学特性

大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，统称为致泻性大肠杆菌，一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性 大肠杆菌（EAEC）。

大肠埃希氏菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。

此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：光滑型、粗糙型、粘液型。大肠埃希氏菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。

大肠埃希氏菌生华物性是，发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇产酸产气，分解蔗糖因菌株而异，录素酶试验阴性，IMVi试验++--，有些菌株如碱性异型菌群，微产碱，不产气，无动力，易与志贺菌混淆。大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。现巳知有171个O抗原、99个K抗原和56个H抗原。 2. 危害程度分类

根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。 3. 致病性和感染剂量

致泻大肠埃希氏菌在人和动物的大便中大量存在，引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病，其中尤以EPEC、ETEC所占比例为大。其中有少数几种引起人类食物中毒，部分埃希氏菌株與嬰兒腹瀉有關，並可引起成人腹瀉或食物中毒的暴發，感染剂量约为107～108。尽管目前报道各地主要腹泻病是由志贺氏菌或轮状病毒引起的，但是，多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性。还有，致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季为高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占60%以上 4. 暴露的潜在后果

摄入是主要的实验室危害，可引起实验人员感染。暴露在气溶胶中能否造成

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危害尚不清楚。 5. 感染途径

通过污染食品和水源经口传播。 6. 微生物在环境中的稳定性

此菌对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但是在30分钟内快速冷冻，将37℃降至4℃的过程，可杀死此菌。加热60℃，30分钟，此菌可灭活。此菌对青霉素有中等抵抗力，对一般消毒剂都比较敏感对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水中1ppb氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗煌绿等染料的抑菌作用 7. 浓度和浓缩标本的容量

一般样本检测。 8. 自然和易感人群宿主

致泻大肠埃希氏菌的宿主主要为牛、猪、羊、鸡等家禽家畜，许多被该微生物污染的食物都不得可以作为传播媒介，幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。 9. 实验操作活动

致泻大肠埃希氏菌巳证明会对实验人员造成危害。摄入是主要的实验室危害，暴露在气溶胶中能否造成危害尚不清楚。

按照国家标准方法对样本（粪便、食品、水样）进行分离，培养，鉴定。建议采用BSL-2级水平的操作技术，防扩散设备和设施。一旦发生意外，按照本实验室的《意外事故应对方案和应急程序》进行处理。 10. 预防和治疗

致泻大肠埃希氏菌引起人体以腹泻症状为主疾病，根据菌型不同可引起如一些疾病：轻度水泻，痢疾样腹泻、出血性腹泻，也可引起食物中毒性疾病。

目前尚无可用于人类的疫苗。对本病的治疗，病人应予胃肠道隔离，除一般治疗外，可根据大便细菌培养及药物敏感试验选用适当的抗菌药物作病原治疗，如选用庆大霉素、丁胺卡那霉素等。

预防致泻大肠埃希氏菌的感染，首先是要做好个人卫生。切实做好饮食卫生、水源及粪便管理,消灭苍蝇,切断传播途径，防止病从口入。

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第六章 伤寒沙门氏菌的生物危害评估报告

伤寒沙门菌，又称伤寒杆菌，属沙门菌属D组。革兰染色阴性，呈短杆状，周有鞭毛，能活动，不产生芽孢，无荚膜。在普通培养基上能生长，在含有胆汁的培养基中生长更好。

伤寒杆菌在自然界中的生活力较强，在水中可存活2—3周，在粪便中能维持1—2个月，在牛奶中不仅能生存，且可繁殖。耐低温，在冰冻环境中可存活数月，但对光、热、干燥及消毒剂的抵抗能力较弱，日光直射数小时即死，加热至60~C后30分钟或煮沸后立即死亡，消毒饮水余氯可迅速致死。

伤寒杆菌只感染人类，在自然条件下不感染动物。伤寒杆菌具有菌体(“O”)抗原、鞭毛(“H”)抗原和表面(“i'’)抗原，均能产生相应的抗体，但这些并非保护性抗体。由于“O”和“H”抗原性较强，故常用于血清凝集试验(肥达反应)以辅助临床诊断，亦可用以制备伤寒菌苗供预防接种。 “i'’抗原见于新分离(特别是从病人血液分离)的菌株，能干扰血清中的杀菌效能和吞噬功能，是伤寒杆菌的重要毒力因子，但其抗原性不强，所产生的“i'’抗体的凝集效价一般较低且为时甚短。当病原菌从人体中清除后，“i'’抗体滴度迅速下降，故“i'’抗体的检出虽对本病的诊断无多大帮助，但有助于发现带菌者。伤寒杆菌在菌体裂解时可释放强烈的内毒素，对本病的发生和发展起着较重要的作用。 1. 流行病学

(一)传染源：为病人及带菌者。病人从潜伏期开始即可从粪便排菌，从病程第1周末开始经尿排菌，故整个病程中均有传染性，尤以病程的2—4周内传染性最大。慢性带菌者是本病不断传播或流行的主要传染源。原有慢性肝胆管疾病(如胆囊炎、胆石症等)的伤寒病人易成为慢性带菌者，约1％—4％患者在肠道和胆囊中隐藏伤寒杆菌达数月或数年之久。

(二)传播途径 伤寒杆菌随病人或带菌者的粪、尿排出后，通过污染的水或食物、日常生活接触、苍蝇和蟑螂等传播。其中，水源污染是本病传播的重要途径，亦是暴发流行的主要原因。食物污染也可引起本病的流行，而散发病例一般以日常生活接触传播为多。

(三)人群易感性 人对伤寒普遍易感。病后可获得持久性免疫，再次患病者极少。

(四)流行特征 世界各地均有本病发生，以热带、亚热带地区多见，可散发、地方性流行或暴发流行。在发展中国家主要因为水源污染而暴发流行，发达国家则以国际旅游感染为主。本病终年可见，但以夏秋季最多。其中以儿童和青壮年居多。局部地区流行的伤寒耐药菌株有所增加，耐药谱也在逐渐扩大。除耐氯霉素、复方磺胺甲嗯唑、氨苄西林外，少数菌株对头孢菌素及喹诺酮类抗菌药物也产生耐药性。 2. 实验室检查

（一）常规检查：血白细胞大多为3×109/L～4×109/L，伴中性粒细胞减少和嗜酸粒细胞消失，后者随病情的好转逐渐回升。极期嗜酸粒细胞＞2%，

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绝对计数超过4×108/L者可基本除外伤寒。高热时可有轻度蛋白尿。粪便隐血试验阳性。

（二）细菌学检查：①血培养是确诊的论据，病程早期即可阳性，第7～10病日阳性率可达90%，第三周降为30%～40%，第四周时常阴性；②骨髓培养阳性率较血培养高，尤适合于已用抗菌素药物治疗，血培养阴性者；③粪便培养，从潜伏期起便可获阳性，第3～4周可高达80%，病后6周阳性率迅速下降，3%患者排菌可超过一年；④尿培养：病程后期阳性率可达25%，但应避免粪便污染；⑤玫瑰疹的刮取物或活检切片也可获阳性培养。

（三）免疫学检查

1.肥达氏试验：伤寒血清凝集试验即肥达反应阳性者对伤寒，副伤寒有辅助诊断价值。检查中所用的抗原有伤寒杆菌菌体（O）抗原，鞭毛（H）抗原，副伤寒甲，乙，丙鞭毛抗原共5种，目的在于用凝集法测定病人血清中各种抗体的凝集效价。病程第1周阳性反应不多，一般从第2周开始阳性率逐渐增高，至第4周可达90%，病愈后阳性反应可持续数月之久。有少数病人抗体很迟才升高，甚至整个病程抗体效价很低（14.4%)或阴性（7.8%～10%），故不能据此而排除本病。

Widal试验已沿用近100年，60年代曾有人对其特异性提出异议，认为其结果存在着混乱模糊的情况，非伤寒发热性疾病Widal's试验也呈阳性结果，如各种急性感染，肿瘤，结缔组织病性疾病，慢性溃疡性结肠炎，均可出现阳性结果。Perlnan等认为无菌的结肠细胞和肠杆菌可能有共同的抗原，结肠粘膜损害所产生的抗结肠抗体与沙门菌菌体抗原起交叉反应，因此对肥达氏反应结果的判定宜审慎，必须密切结合临床资料，还应强调恢复期血清抗体效价的对比，有人提出应用流行菌株抗原与国际菌株相比，阳性率可提高，建议用当地流行菌株取代国际标准菌株，以提高流行区域伤寒诊断的阳率。

2.其他免疫学检查

（1）被动血凝试验（PHA）：用伤寒杆菌菌体抗原致敏红细胞，使之与被检血清反应，根据红细胞凝集状况判断有无伤寒特异性抗体存在，国内外报道阳性率90%～98.35%，假阳性率5%左右。鲍行豪等曾报道LSP-PHA对伤寒血培养患者的检出率为.66%，早期病人90.02%，临床确诊者为82.5%，且主要检测的是特异IgM抗体，故可用于早期诊断。

（2）对流免疫电泳（CIE）：本方法可用于血清中可溶性伤寒抗原或抗体的检测，操作简便，便于基层推广，特异性较高；但敏感性较低，不同作者报道为24%～92%，主要受采集血清时间的影响，发病初期最易测出，故可用于伤寒的早期诊断。

（3）协同凝集试验（COA）：利用金葡菌的葡萄球菌A蛋白（SPA）可（2）对流免疫电泳（CIE）：本方法可用于血清中可溶性伤寒抗原或抗体的检测，操作简便，便于基层推广，特异性较高；但敏感性较低，不同作者报道为24%～92%，主要受采集血清时间的影响，发病初期最易测出，故可用于伤寒的早期诊断。

（4）免疫荧光试验（IFT）：Doshi等用伤寒杆菌菌体Vi悬液作抗原进行间接免疫荧光抗体检测，140例血培养阳性的伤寒患者134例（95.7%）阳性；394例对照者仅4例（1%）假阳性，目前有关本法的报道尚少，伤寒疫预防接种和其它沙门氏菌感染是否会影响本试验特异性，尚需进一步研究。

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（5）酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA的基本原理是用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，既可检测抗原，又可检测抗体，用ELISA法检测伤寒患者Vi抗原，灵敏性达1ng/ml，高于CoA法9100ng/ml，并可检测到1∶1024稀释后尿液中的Vi抗原。国内、外用ELISA检测过临床标本中的Vi抗原，V9抗原，LPS，H抗原等，敏感性在62.5%～93.1%，因检测抗原的不同而异，多数在80%以上。杭州鲍行豪等应用ELISA同时检测IgM和IgG抗体，LPS-IgM-ELISA的敏感性为91.38%，特异性为99.02%，LPS-IgG-ELISA分别为93.1%和98.02%，在伤寒的血清免疫学诊断方法中，ELISA方法简便，快速，敏感，特异性高，是公认较好的一种诊断方法。

（四）分子生物学诊断方法

1.DNA探针（DNA Probe） DNA探针是用DNA制备的诊断试剂，用于检测或鉴定特定的细菌，方法是用一段已标记的特定的DNA片段（探针）与标本中已变性的细菌DNA杂交，通过测定是否发生杂交反应来达到检测目的，由于此探针是以细菌专有的特异性基因片断制备，故特异性很高。用DNA探针对培养所得的伤寒杆菌进行检测，敏感性需标本中达1000个细菌才能检出。DNA Probe的特异性高而敏感性低，一般用于菌种鉴定及分离。

2.聚合酶链反应（PCR） PCR方法是80年代中后期发展起来的一种分子生物学方法，它能在数小时内在体外将目标基因或DNA片段扩增到数百万倍，检出率较DNA探针高100～10000倍，国外Jae HS等用PCR方法扩增伤寒的鞭毛抗原编码基因，敏感度能检出10个伤寒菌，特异性为100%，PCR方法因其高度敏感，易出现产物污染，所以控制PCR方法的假阳性及假阴性，是提高准确度的关键。 3. 细菌的生物安全防护

在实验室操作上对于有高风险的人员，如免疫缺陷者，要严格进入。对于针头和锐器要有警示，要用专门存放锐器的容器盛装。在个人防护上，要求穿隔离衣，出实验室时应将隔离衣脱下；在可能接触病原时要戴一次性使用的手套，但不要戴手套接触清洁表面（如电话等），脱去手套后要洗手；在BSC外面进行操作时，要进行面部保护，如套口罩、眼罩、面罩等。要有泡手消毒缸和洗眼台，还要有高压消毒器

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第七章 志贺氏菌的生物危害评估报告

1. 生物学特性

志贺氏菌属（Shigella） 的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。

志贺氏菌和大肠杆菌都属于肠杆菌科，根据DNA杂交研究结果表明，志贺氏菌属的四个种和大肠杆菌属在生化上是难以区分的，因为有产气的志贺氏菌，也有乳糖阴性、不产气、不运动的大肠杆菌，有些大肠杆菌也能引起痢疾状的腹泻。

志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。

志贺氏菌需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本属细菌分为四个群、39个血清型。 2. 危害程度分类

根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。 3. 致病性和感染剂量

志贺氏菌引起的细菌性痢疾，主要通过消化道途径传播。根据宿主的健康状况和年龄，只需少量病菌（至少为10～100个细胞）进入，就有可能致病。致病因素：志贺氏菌的致病作用，主要是侵袭力、菌体内毒素个别菌株能产生外毒素。志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类一类是急性细菌性痢疾：又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型；二类是慢性细菌性痢疾：又分慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型三型。病后有一定的免疫力，但免疫期短，也不稳定。

4. 暴露的潜在后果

暴露后可能引起感染，菌量大时可使实验人员显性感染，菌量很少时常呈暂时的带菌状态。被感不染后，成为传染源，可能对周围及环境造成污染，应及时得到控制。 5. 感染途径

通过污染食品和水源经口传播，无其它感染途径。 6. 微生物在环境中的稳定性

志贺氏菌属在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34天，37℃水中存活20天，在粪便内（室温）

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存活11天。日光直接照射30分钟，56-60℃10分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。 7. 浓度和浓缩标本的容量

一般样本检测。 8. 自然和易感人群宿主

人和灵长类是志贺氏菌的适宜宿主，营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。 9. 实验操作活动

巳有文献证明，志贺氏菌可造成实验人员感染细菌性痢疾，仅在美国和英国就有数十例报告。尽管在捕获的非灵长类动物中曾有过暴发，但人类是惟一重要的传染源。然而，实验室感染的豚鼠、其他啮齿类动物和非人灵长类动物也是被证实的传染源。

这种病原体可以存在于受感染的人或动物的粪便中，极少存在于血液中。摄入及胃肠道外接种该病原体是主要的实验危害。人类经口感染福氏志贺菌的ID25～50大约是200个细菌。暴露在气溶胶中能否引起感染目前还不清楚。

按照国家标准方法对样本（粪便、食品、水样）进行分离，培养，鉴定。建议采用BSL-2级水平的操作技术，防扩散设备和设施。一旦发生意外，按照本实验室的《意外事故应对方案和应急程序》进行处理。 10. 预防和治疗

志贺氏蓖可引起细菌性痢疾。细菌性痢疾又可分为两类，一类是急性细菌性痢疾：又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型；二类是慢性细菌性痢疾：又分慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型三型。

目前疫苗还不可用于人类。对本病的治疗，病人应予胃肠道隔离，除一般治疗外，可根据大便细菌培养及药物敏感试验选用适当的抗菌药物作病原治疗。如复方磺胺甲基异唑、氯霉素、庆大霉素及卡那霉素等。亦可应用氨苄青霉素或氧哌嗪青霉素等治疗。中毒性痢疾应予相应的抢救措施，如抗休克、冬眠药物和脱水药的应用等。慢性菌痢可采用保留灌肠的方法治疗。。

预防沙门氏菌感染，首先是要消灭传染源是预防措施之一，除治愈患者外，必须对托幼、饮食业及自来水厂工作人员定期检查，及时发现带菌者，调离工作岗位并予以治疗。切实做好饮食卫生、水源及粪便管理,消灭苍蝇,切断传播途径，防止病从口入。

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第八章 蜡样芽胞杆菌的生物危害评估报告

1. 细菌的传播与致病

蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国则主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。

1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对日本名古屋所采11份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%；1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。

蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60-100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。

当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中毒。蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期为6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。严重者还可导致败血症。

蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌可产生肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯，致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的肠毒素分子量为55-6.0×103。致腹泻的肠毒素能使小白鼠致死。 2. 细菌的生物学特性

蜡样芽胞杆菌分类为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌属“大细胞菌种”。

蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1-1.3×3-5μm，需氧或兼性需氧，生长6h即可形成原形芽胞，芽胞位于菌体的中心或次末端不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力无荚膜。它的生长温度为25-37℃，最佳温度30-35℃。在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上生成的菌落较大，直径

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3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状故而得名。偶有产生黄绿色色素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血。在甘露醇、卵黄多粘菌素（MYP）平板上，呈伊红粉色菌落。能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨素等，VP实验阳性，可液化明胶，卵磷脂酶阳性，但多次传代后，其生化特性常可改变。

此外蜡杆芽胞杆菌耐热，其食物中毒菌株中的游离芽胞能耐受100℃30分钟，而干热灭菌需120℃60分钟才能杀死。本菌对氯霉素、红霉素和庆大霉素敏感，对青霉素、磺胺类和呋喃类耐药。 3. 细菌的实验室检查及其它检查

1.标本收集 采集可疑食物或收集粪便和呕吐物进行直接涂片染色镜检和其他操作。

2.活菌计数 无菌操作称取样品50g放入灭菌搅拌缸内。加Butterfield磷酸盐缓冲稀释液450mL，以高速（18.000-21.000rpm）均质2min。用上述1:10稀释液，连续稀释供蜡样芽胞杆菌计数。移取10mL均质样液（1:10稀释）加到90mL空白液中，从10-2到10-6制备一系列稀释液，充分混匀，并继续稀释直到10-6为止。取样品的各个稀释液（包括1:10）0.1mL接种2只MYP（甘露醇一卵黄多粘菌素琼脂）平板，用灭菌玻璃棒在每只平板表面涂布均匀。将平板置30℃培养24小时，并检查菌落周围有沉淀圈者，表示产生卵磷脂酶。蜡样芽胞杆菌菌落通常是粉红色，随着培养时间的延长则更明显。如果上述反应不清晰，应将平板再培养24小时后计数，从MYP平板上挑取典型菌落5个或更多，移种到营养琼脂斜面上供蜡样芽胞杆菌证实试验用。

3.MPN技术被推荐用于食品中低于10个/g蜡样芽胞杆菌的检验。某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也可用此法检验。在胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中接种3管MPN系列，10-1、10-2、10-3的稀释液各接种1mL于3管。将培养管置30℃培养48±2小时，检查生长密集、典型的蜡样芽胞杆菌。将阳性管培养物划线接种于MYP平板，于30℃培养24-48小时。以下步骤同2。

4.分离培养 将可疑食物置无菌乳钵中，加适量生理盐水研磨后，划线接种于普通琼脂平板或血琼脂平板，若为呕吐物可直接划线接种于上述平板，于37℃培养。

5.若有类似蜡样芽胞杆菌的菌落出现再进一步分离纯化以及进行生化反应。 6.蜡样芽胞杆菌的证实试验 蜡样芽胞杆菌的分离物应符合下述条件：1)革兰氏阳性产芽胞大杆菌，其芽胞不突出体外；2）在MYP琼脂上产生卵磷脂酶而不发酵甘露醇；3）厌氧培养生长，发酵葡萄糖产酸；4）还原盐；5）VP阳性；6）分介L-酪氨酸；7）在含0.001%溶菌酶的培养基中能生长。

7.蜡样芽胞杆菌群的鉴别试验要鉴别典型蜡样芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌群的其它种还需进一步进行下述试验：1）动力试验；2）根状生长试验；3）溶菌活性试验；4）蛋白质毒素结晶试验：蜡样芽胞杆菌有动力、强溶血、不形成根状菌落，或不产生蛋白质毒素结晶。而且蜡样芽胞杆菌在4℃、pH4.3、盐浓度18%的条件下仍能存活或生长。通过高温杀菌或适当的冷藏可以控制蜡样芽胞杆菌的增殖。

8.血清学分型、噬菌体分型。 4. 细菌的防治

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蜡样芽胞杆菌所引起的食物中毒多因食品在食用前保存温度较高（20℃以上）和放置时间较长，故对中毒的预防包括：由于蜡样芽胞杆菌在15℃以下不繁殖，剩饭、剩菜应放在低温保存。该菌污染的食品一般无变质的异味，不易被发觉。因此，剩饭、剩菜在食用前一定要再加热。注意食品的贮藏和个人卫生，防止尘土、昆虫及其他不洁物污染食品。

若一旦发生了中毒，则立即停止食用可疑污染的食品，多饮水。一般不需要使用抗生素治疗。腹泻较重者可到医院就诊。 5. 细菌的生物安全防护

根据《病原微生物生物实验室生物安全管理条例》中的有关规定，人间传播的微生物名录（待颁布）蜡样芽胞杆菌属于三类，BSL-2。

（1）操作要求

1、实验时，未经实验室主任同意，或禁止进入实验室。

2、不许在工作区域饮食、吸烟、清洗隐型眼镜和化妆。食物应存放在工作区域以外专用橱柜或冰箱中。

3、所有的操作过程应尽量细心，避免产生和溅出气溶胶。

4、对于污染的锐器，必须时刻保持高度的警惕，包括针、注射器、玻片、加样器等。

5、注射和吸取感染材料时，只能使用针头固定注射器或一次性注射器（即注射器和针头是一体的）。用过的一次性针头必须弯曲、切断、破碎、重新套上针头套、从一次性注射器上去掉，或在丢弃前进行人工处理，要不将之小心放入不会被刺穿的、用于收集废弃锐器的容器中。非一次性锐器必须放置在坚壁容器中，转移至处理区消毒，最好高压杀菌。

6、打碎的器皿不能直接用手处理，必须用其它工具处理，如刷子和簸箕、夹子或镊子。盛污染的针头、锐器、碎玻璃的容器在倒掉前，应按照相关的规定进行消毒。

7、所有的培养物、储存物及其它规定的废物在释放前，均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌。转移到就近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内，密封运出实验室。离开该系统进行消毒的物料，在转移前应包装，其包装应符合有关的法规。

8、溅出或偶然事件中，明显暴露于传染源时，要立即向实验室主任报告。进行适当的医学评估、观察、治疗，保留书面记录。

9、按日常程序、在有关传染源的工作结束后、尤其是传染源溅出或洒出后、或受到其他传染源污染后，实验室设备和工作台面应当使用有效的消毒剂消毒。污染的设备在送去修理、维护前，要按照相关的规定消毒；在离开设施转移前，要按照相关的规定打包运输。

（2）安全设备

1、正确使用和保养生物安全柜、最好是二级生物安全柜、或其他合适的人员防护设施、或物理遏制装置。

2、确定可能形成传染性气溶胶或溅出物的实验过程，包括离心、研磨、匀浆、剧烈震荡或混匀、超声波破裂、开启装有传染源的容器、采集感染标本等。

3、涉及高浓度或大体积的传染源时，若选用密封转头或带安全罩的离心机，若转头或安全罩仅在生物安全柜中打开，则可在开放实验室内离心。

4、当必须在生物安全柜外处理标本时，需采取面部保护措施（跟镜、口罩、

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面罩、或其他防溅装置），以免传染源或其他有害物溅或洒到面上。

5、在实验室内，必须使用专用的防护性外衣、大褂、罩衫或制服。人员到非实验室区域时，防护服必须留在实验室内。防护服可以在实验室内处理，也可以在洗衣房中洗涤，但不能带回家中。

6、可能接触潜在传染源、被污染的表面或设备时，要戴手套。一次性手套不用清洗、不能重复使用，不能用于接触“洁净”的表面（键盘、电话等），也不应当戴着到实验室外。要备有带滑石粉的乳胶手套。脱掉手套后，要洗手。

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第九章 单核增生李斯特菌的危害评估报告

1. 细菌的传播与致病

产单核李斯特菌是李斯特菌属中唯一可对人类致病的菌种，能够引起李斯特菌病，主要表现为脑膜炎和败血症。健康的带菌者是主要的传染源，可以经粪-口途径传播，也可以通过胎盘和产道由带菌的母亲感染给新生儿。如果人的眼睛或皮肤与带菌的病畜直接接触，也可造成局部感染。产单核李斯特还能引起鱼类、鸟类和哺乳动物牛、羊等多种动物疾病。 2. 细菌的生物学特性

产单核李斯特菌是一种革兰阳性短小杆菌，大小约为1~2μm×0.4~0.5μm，通常成双排列，偶尔可见双球状。有鞭毛，但仅在18~20℃有动力，在37℃动力缓慢。无芽胞，一般不形成荚膜，但在含有血清的葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜。兼性厌氧，对营养要求不高，普通培养基上可生长，在血平板上会形成β-溶血。最适的生长温度是30~37℃，并可在4℃条件下进行冷增菌。

产单核李斯特菌与葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌等及大肠埃希菌具有共同抗原。根据菌体及鞭毛抗原的不同，可将其分为4个血清型，1、3、4型还可分为若干亚型。抗原的结构与毒力无关，致病的物质主要是溶血素和菌体表面成分。其中1型主要感染啮齿动物，4型主要感染反刍动物。但各型均可对人类致病，尤以1a和1b最为多见。

本菌耐碱不耐酸，对热较为敏感，加热50℃10min即可死亡。同时该菌对多种抗生素敏感，以氨苄青霉素为首选，尚有青霉素、链霉素、四环素、氯霉素和红霉素等敏感。但该菌对磺胺、杆菌肽和多粘菌素耐药。 3. 细菌的实验室检查

1、标本采集 采集来自临床的各种标本，如脑脊液和血液。此外还可根据症状采集子宫、子宫颈、阴道、鼻咽部等部位的分泌物或组织，还有新生儿脐带残端、羊水及胎粪、尿等送检。

2、涂片镜检 除了血液标本外，其余标本都可以涂片做革兰染色镜检，或用产单核李斯特菌1型和4型及多价荧光抗体进行染色。

3、动力检查 在18~20℃有动力，在37℃动力缓慢。若发现有动力，应立即报告并及早进行抗生素治疗，以预防本菌败血症或脑膜炎的发生。

4、分离培养 取脑脊液离心后的沉淀物划线接种于羊血琼脂平板上，于10%CO2环境中进行培养，35℃孵育18~24h；血液标本5ml注入含有50ml培养基的血培养瓶中，同样在含10% CO2环境中进行培养；咽喉拭子、组织及粪便标本可接种于肉汤培养基置4℃冰箱中进行冷增菌。结果：产单核李斯特菌在血琼脂平板上能产生狭窄的β-溶血环，菌落呈灰白色，直径1~2mm；在肉汤中呈均匀混浊生长表面形成薄膜；在半固体培养基内，可形成倒伞形生长。

5、生化鉴定 本菌可发酵多种糖类如葡萄糖、果糖、覃糖、麦芽糖核水杨素，产酸不产气。甲基红和V-P实验阳性，触酶阳性，可使石蕊牛乳缓慢产酸并使其脱色，能水解精氨酸产氨。不还原盐、不形成吲哚、不液化明胶和凝固血清，不分解尿素。能水解七叶苷，有时还可形成硫化氢。

6、血清学实验 用已知的李斯特菌1型、4型和多价抗血清玻片凝集试验对

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可疑菌进行鉴定。

7、动物结膜点种试验 取幼兔或豚鼠一只，用本菌24h肉汤培养物1滴，滴入实验。

8、动物一侧的结膜囊内，以另一侧为对照，观察5天。一般产单核李斯特菌会在接种后的24~36h内，出现化脓性结膜炎。 4. 细菌的生物安全防护

根据《病原微生物生物实验室生物安全管理条例》中的有关规定，人间传播的微生物名录（待颁布）产单核李斯特菌属于三类，BSL-2。相关的防护事宜包括：

（1）操作要求

1、实验时，未经实验室主任同意，或禁止进入实验室。

2、不许在工作区域饮食、吸烟、清洗隐型眼镜和化妆。食物应存放在工作区域以外专用橱柜或冰箱中。

3、对于污染的锐器，必须时刻保持高度的警惕，包括针、注射器、玻片、加样器等。

4、注射和吸取感染材料时，只能使用针头固定注射器或一次性注射器（即注射器和针头是一体的）。用过的一次性针头必须弯曲、切断、破碎、重新套上针头套、从一次性注射器上去掉，或在丢弃前进行人工处理，要不将之小心放入不会被刺穿的、用于收集废弃锐器的容器中。非一次性锐器必须放置在坚壁容器中，转移至处理区消毒，最好高压杀菌。

5、打碎的器皿不能直接用手处理，必须用其它工具处理，如刷子和簸箕、夹子或镊子。盛污染的针头、锐器、碎玻璃的容器在倒掉前，应按照相关的规定进行消毒。

6、所有的培养物、储存物及其它规定的废物在释放前，均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌。转移到就近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内，密封运出实验室。离开该系统进行消毒的物料，在转移前应包装，其包装应符合有关的法规。

7、按日常程序、在有关传染源的工作结束后、尤其是传染源溅出或洒出后、或受到其他传染源污染后，实验室设备和工作台面应当使用有效的消毒剂消毒。污染的设备在送去修理、维护前，要按照相关的规定消毒；在离开设施转移前，要按照相关的规定打包运输。

（2）安全设备

1、正确使用和保养生物安全柜、最好是二级生物安全柜、或其他合适的人员防护设施、或物理遏制装置。

2、确定可能形成传染性气溶胶或溅出物的实验过程，包括离心、研磨、匀浆、剧烈震荡或混匀、超声波破裂、开启装有传染源的容器、采集感染标本等。

3、涉及高浓度或大体积的传染源时，若选用密封转头或带安全罩的离心机，若转头或安全罩仅在生物安全柜中打开，则可在开放实验室内离心。

4、在实验室内，必须使用专用的防护性外衣、大褂、罩衫或制服。人员到非实验室区域时，防护服必须留在实验室内。防护服可以在实验室内处理，也可以在洗衣房中洗涤，但不能带回家中。

5、可能接触潜在传染源、被污染的表面或设备时，要戴手套。一次性手套不用清洗、不能重复使用，不能用于接触“洁净”的表面（键盘、电话等），也

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不应当戴着到实验室外。要备有带滑石粉的乳胶手套。脱掉手套后，要洗手。

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第十章 流感病毒的危害评估报告

流感病毒属正粘病毒科，分甲、乙、丙三型。具有“变异”特性，不断产生新的亚型。可引起人或家禽的流行性感冒。这是一种急性呼吸道传染病，它具有突然暴发、迅速蔓延、波及面广的特点。在人群中，它的发病率高，病死率低，多发于青少年，恢复快，具有一定季节性。而禽流感发病率和病死率高，季节性不强，来源常不明。20世纪曾有4次流感大流行。流感流行时造成的经济损失名列各传染病之首。流感是第一个实行全球监测的传染病。

病人和病禽是主要的传染源。传播途径以空气飞沫传播为主，也存在通过水源、密切接触、垂直传播、蚊虫传播等多种途径。人群普遍易感，病后免疫时间短，而流感病毒变异性大，但型间无交叉免疫，所以人在一生中可多次患流感。

流感病毒在外界的抵抗力弱，在56℃30分钟条件下易被灭活，在室温下传染性很快丧失，100℃1分钟即被灭活，但在0～4℃能存活数周，在 -20℃真空干燥条件下可长期保存。对紫外线和化学有毒剂敏感。病毒暴露于通常使用的各种消毒剂和固定剂后，病毒即失去感染性。

流感极易传播，因此发现有流感病人，应及早隔离和治疗。流感流行期间尽可能避免人群集聚，注意房屋通风，提倡在公共场所戴口罩，病人的口鼻腔分泌物及污染物应随时消毒。疫苗接种对预防流感有一定效果。保持环境卫生，养成良好的卫生习惯也能起预防作用。流感是一自限性疾病，可使用抗流感病毒药物和对症治疗来减轻症状。用抗菌素防止细菌继发感染产生的并发症。 1. 实验模式

1.1 流感病毒的分离培养

流感病毒大量存在于病人痰液、咽拭子和病禽尸解脏器中。分离流感病毒时，可用鸡胚，最好用SPF鸡胚，但一般只采用尿囊腔接种；也可用狗肾细胞（MDCK）。

1.2 流感病毒血清学诊断

血凝抑制试验（HI法）或微量中和法。

必须采集双份血清，疾病发作时头3天立即采集（急性期血清），发病后2-3周采集（恢复期血清），在同一条件下进行HI测定，在恢复期血清HI抗体滴度比急性期的高4倍或以上，就可加以确诊。 1.3 流感病毒抗体检测

可用免疫荧光法和ELISA。 1.4 流感病毒核酸检测

逆转录PCR 2. 实验中危害因素分析

流感传播途径以空气飞沫传播为主，也存在通过水源、密切接触、垂直传播、蚊虫传播等多种途径。操作具有高致病性的甲性H5和H7两亚型毒株必须在P3实验室内进行操作。特别是一些甲性流感毒株（H5N1，H9N2）通过何种途径传染人至今不清楚，因此采集标本时，须做好一定的个人防护。

流感病毒易发生基因重配，易形成新的亚型，但型间无交叉免疫。

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3. 安全措施

3.1 严格按实验室使用和安全操作技术规程及各个实验项目的操作技术规程操作。

3.2 加强个人防护。采用符合国家标准的口罩、防护服等个人防护用品， 3.3 强化离心、移液等环节的标准操作。

3.4 抗体检测用血清标本可先以56℃30分钟处理。

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第十一章 禽流感病毒的危害评估报告

禽流感病毒（AIV）属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些亚型也可感染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类；乙型和丙型流感病毒则分别见于海豹和猪的感染。甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素（H）/和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，目前可分为15个H亚型（H1～H15）和9个N亚型（N1～N9）。感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。

研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株（H5N2、H7N7、H9N2），可经6～9个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株（H5N1）。

一般来说，禽流感病毒与人流感病毒存在受体特异性差异，禽流感病毒是不容易感染给人的。个别造成人感染发病的禽流感病毒可能是发生了变异的病毒。变异的可能性一是两种以上的病毒进入同一细胞进行重组，如猪既可感染人流感病毒，又可能感染禽流感病毒，每种病毒都具有8个基因片段，从理论上讲，可以形成256个新的重组病毒；二是病毒基因位点由于某种因素的影响，⑸槐洹?983年4月，美国宾夕法尼亚州曾暴发H5N2型病毒引起的鸡和火鸡低致病性禽流感，由于没有及时得到有效控制，到同年10月份，同样的H5N2型毒株突然由低致病性变成高致病性，造成禽类大量死亡。

禽流感病毒对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂均敏感。常用消毒剂容易将其灭活，如氧化剂、稀酸、十二烷基硫酸钠、卤素化合物（如漂白粉和碘剂）等都能迅速破坏其传染性。

禽流感病毒对热比较敏感，65°C加热30min或煮沸（100°C）2min以上可灭活。病毒在粪便中可存活1周，在水中可存活1个月，在pH﹤4.1的条件下也具有存活能力。病毒对低抗温抵力较强，在有甘油保护的情况下可保持活力1年以上。

病毒在直射阳光下40～48h即可灭活，如果用紫外线直接照射，可迅速破坏其传染性。

禽流感病毒可在水禽的消化道中繁殖。 （一）传染源

主要为患禽流感或携带禽流感病毒的家禽，另外野禽或猪也可成为传染源。许多家禽都可感染病毒发病：火鸡、鸡、鸽子、珍珠鸡、鹌鹑、鹦鹉等陆禽都可感染发病，但以火鸡和鸡最为易感，发病率和死亡率都很高；鸭和鹅等水禽也易感染，并可带毒或隐性感染，有时也会大量死亡。各种日龄的鸡和火鸡都可感染发病死亡，而对于水禽如雏鸭、雏鹅其死亡率较高。

除野禽，如天鹅、燕鸥、野鸭、海岸鸟和海鸟等外，还从以下多种鸟中分离到流感病毒；燕八哥、石鸡、麻雀、乌鸦、寒鸦、鸽、岩鹧鸪、燕子、苍鹭、加拿大鹅及番鸭等。据国外报道，已发现带禽流感病毒的鸟类达88种，而鼠类不能自然感染流感病毒。

不同品种的家禽感染禽流感的几率不同，但目前尚未发现高致病性禽流感的

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发生与禽的性别有关，高致病性禽流感病毒也可通过鸡蛋传播。

高致病性禽流流在禽群之间的传播主要依靠水平传播，如空气、粪便、饲料和饮水等；而垂直传播的证据很少。但通过实验表明，实验感染鸡的蛋中含有流感病毒，因此不能完全排除垂直传播的可能性。所以，不能用污染鸡群的种蛋做孵化用。

病毒可以随病禽的呼吸道、眼鼻分泌物、粪便排出，禽类通过消化道和呼吸道途径感染发病。被病禽粪便、分泌物污染的任何物体，如饲料、禽舍、笼具、饲养管理用具、饮水、空气、运输车辆、人、昆虫等都可能传播病毒。 （二）传播途径

主要经呼吸道传播，通过密切接触感染的禽类及其分泌物、排泄物，受病毒污染的水等，以及直接接触病毒毒株被感染。在感染水禽的粪便中含有高浓度的病毒，并通过污染的水源泉由粪便-口途径传播流感病毒。目前还没有发现人感染的隐性带毒者，尚无人与人之间传播的确切证据。

人类对禽流感的研究和防治工作已有100多年的历史。目前研究结果表明，禽流感病毒中缺乏人流感病毒的基因片段，除非禽流感病毒与人流感病毒发生基因重组，否则它很难侵犯人类，导致人与人间传播。人禽流感的发生，目前只可能是因接触的病禽而感染。人感染病毒的几率很小。 （三）易感人群

一般认为任何年龄均具有易感性，但12岁以下儿童发病率较高，病情较重。与不明原因病死家禽或感染、疑似感染禽流感家禽密切接触人员为高危人群。 （四）流行特征

禽流感是世界范围分布的，1994年、1997年、1999年和2003年分别在澳大利亚、意大利、中国、荷兰等地爆发，2005年则主要在东南亚和欧洲爆发。除鸡群中的禽流感主要发生在冬、春季节外，没有其他明显的规律性。高致病性禽流感疫情的蔓延引起世界关注。我国气象专家对疫情地气候特征的分析表明，禽流感“不喜”睛热天气。

世界卫生组织（WHO）认为，病禽粪便是传播的主要渠道，也有专家认为，候鸟的迁徙也是传播途径之一。

天气气候条件作为自然环境中的一个重要因子，其变化或异常通常会对一些疾病的发生、加重或缓解起一定作用。专家认为，禽流感病毒喜欢冷凉和潮湿，阳光中的紫外线对病毒有一定的杀灭作用。冬末春初，冷空气活动频繁，气温忽高忽低，对控制和预防禽流感的发生将是不利的。另外，随着气温的回暖，候鸟将会向北迁徙，候鸟传播病毒的范围将会扩大，对控制禽流感发生也将是不利的。

WHO认为，病鸡粪便中的H5N1禽流感病毒株会散布在空气中，并被风带走而传播禽流感。从日照时数看，分析材料显示，日照较少的地区易发生禽流感。这与农业专家提出的禽流感病毒在阳光下只能存活24～28h，一般多在冬春两季流行，在5～10月份就基本平复的观点是一致的。

高致病性禽流感病毒主要通过空气进行传染，借助病毒表面的血凝素（H），与呼吸道黏膜上皮细胞表面的相应受体结合，吸附可宿主的呼吸道上皮细胞上。又借助病毒表面的神经氨酸酶（N）作用于核蛋白的受体，使病毒和上皮细胞的核蛋白结合，在核内组成RNA型可溶性抗原，并渗出至胞质周围，复制子代病

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毒，通过神经氨酸本作用，以出芽方式排出上皮细胞。一个复制过程的周期为4～6h，排出的病毒扩散至附近细胞，产生炎症反应，临床上出现发热，肌肉痛和白细胞减低等全身毒血症样反应。

病毒主要侵入呼吸道黏膜的上皮细胞，引起上皮细胞增生、坏死、黏膜局部充血、水肿和浅表溃疡等卡他性病变。4～5d后，基底细胞层病变可扩展到支气管、细支气管、肺泡和支气管周围组织，引起黏膜水肿、充血、淋巴细胞浸润，并伴有微血管栓塞、坏死、小动脉瘤形成和出血等，引发全身毒血症样反应。少数重症进行性肺炎除细支气管炎症变化外，可有肺泡壁充血水肿、纤维蛋白渗出，单核细胞浸润和透明膜形成，以及肺出血等，引起诸多并发症。

高致病性禽流感病毒毒力较强，引发的传染性变态反应（IV型变态反应）是导致进行性肺炎、急性呼吸窘迫综合证（ARDS）和多器官功能障碍综合征（MODS）等严重并发症的根本原因。 (五) 禽流感的预防控制措施

1. 加强禽类疾病的监测，一旦发现禽流感疫情，动物防疫部门立即按有关规定进行处理。从事养殖业及禽类加工处理的所有相关人员都要做好个人防护工作。

2. 加强对密切接触禽类人员的监测。当这些人员中出现流感样症状时，应立即进行流行病学调查，采集病人标本并送至指定实验室检测，以进一步明确病原，同时应采取相应的防治措施。

3. 接触人禽流感患者应戴口罩、戴手套、穿隔离衣。接触后应洗手。 4.要加强检测标本和实验室禽流感病毒毒株的管理，严格执行操作规范，防止医院感染和实验室的感染及传播。

5. 注意饮食卫生，不喝生水，不吃未熟的肉类及蛋类等食品；勤洗手，养成良好的个人卫生习惯。

6. 药物预防，对密切接触者必要时可试用抗流感病毒药物或按中医药辩证施防。

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第十二章 肠道病毒71型的危害评估报告

1. 基本概述

肠道病毒71型（英文名为：Human enterovirus 71）。简称EV71。1957年，新西兰首次爆发大规模疫情并报道。1958年，首次分离出柯萨奇病毒（Coxsackieviruses）。1959年，有了手足口病（hand - foot and mouth disease；HFMD）的命名。

人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的，这些病毒可被培养在恒河猴肾脏细胞(rhesus monkey kidney cell；RhMK)及人胚二倍体细胞（human fetal diploid cell）中。若检体取自病人粪便及组织即以人胚肾二倍体细胞（diploid strain of human fetal kidney cell；HFDK）培养；若为咽喉拭子检体则选用人胚肺二倍体细胞细胞（diploid strain of human fetal lung cell）培养。经由这些细胞培养后纯株化病毒分析，发现会出现典型由肠病毒所致的细胞病变（cytopathetic effect；CPE）现象，由电子显微镜下观察其形态（morphology）及物理化学（physicochemical）特性都与当时已知的其他肠病毒类似，但进行中和抗体试验（neutralization test）或免疫扩散试验（immunodiffusion test）后，却发现其彼此间并不会有交互作用的现象，因此推测当时所发现的病毒为一种新型的肠病毒，故将该病毒株命名为肠病毒71型。 2. 临床表现

肠道病毒71型感染

EV71主要引起手足口病，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种神经系统疾病。手足口病和中枢神经系统感染是EV71感染而引起的两大常见临床症状。 2.1 手足口病

人们最早发现手足口病的病原是柯萨奇A16（CA16），后来发现柯萨奇病毒A组4型、5型、9型、10型以及B组2型和5型等肠道病毒也可引起手足口病。自1969年首次分离到EV71以来，人们逐渐认识到EV71是手足口病的主要病原。此病传染性强，常见全家发病，并可造成局部暴发流行。患者以4～5岁以下小儿多见，成人也可患病，但病情多较轻。一年四季均可发病，以5、6月份为多发。潜伏期2～5日。传播途径不仅是粪-口传播，病毒主要通过人群间的密切接触进行传播，人群密集处易发生病毒的流行，幼托机构内的学龄前儿童是感染的高危人群。

感染初期患者表现为低热、流涕、食欲下降、口痛、呕吐、腹泻等。口腔黏膜出现小疱疹，常分布于舌、颊黏膜、硬腭，也可以出现在扁桃体、牙龈及咽部等，疱疹破溃后形成溃疡。在口腔病变的同时皮肤可以出现斑丘疹，以手足为多见，皮疹主要分布于手背、指间，偶见于躯干、大腿、臀部、上臂等处，呈离心性分布，斑丘疹很快转为小疱疹，直径约3～7mm，质地稍硬，自几个至数十个不等，2～3日自行吸收，不留痂。大多数为良性过程，多自愈，但可复发，有时伴发无菌性脑膜炎、心肌炎等。在马来西亚、我国省、新加坡、特别行政区、澳大利亚等地暴发的手足口病中，均出现与EV71感染有关的严重中枢

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感染，甚至发生致死性脑病、肺出血和心肌炎猝死。EV71累及神经系统多发生于5岁以下儿童，1～2岁幼儿发病率最高。 2.2 中枢神经系统感染

EV71累及神经系统主要表现为无菌性脑膜炎、脑炎及瘫痪性疾病，多发生于5岁以下幼儿，1岁以下婴儿发病率最高。临床表现变化多样，病情轻重不一，一般表现为阵挛、呕吐、共济失调、意向性震颤、眼球震颤及情感淡漠等。头颅MRI及脑电图检查有助于明确疾病的严重性。 2.3 神经源性肺水肿

最早描述EV71感染引起的神经源性肺水肿来自1995年美国的一个3岁女孩，大量的病例来源于亚太地区的EV71流行。其症状为起病第1～3天内突然发生心动过速、呼吸困难、发绀和休克，胸片显示双侧对称性非心源性肺水肿，90％的病例于发病后12小时内死亡。大量尸检和组织病理学研究表明，EV71引起的肺水肿是神经源性的。EV71首先破坏脑干组织特定的具调节功能的结构，引起自主神经功能的紊乱，最终导致肺水肿。Chang等的研究还表明，高血糖、白细胞升高和急性松弛性瘫痪共同构成了神经源性肺水肿的高危因素，其机制尚不清楚。

2.4 其他表现

发热是婴幼儿EV71感染的常见临床症状，患者绝大多数是小于6个月婴儿。急性呼吸道疾病是EV71感染的又一常见临床症状，在澳大利亚、加拿大和1998年我国省的EV71流行中都有报道。它包括一些常见呼吸道症状，如咽炎、哮喘、细支气管炎和肺炎，发病年龄一般为1～3岁，需要住院治疗。急性咽喉炎也是EV71的一个临床症状，在中国特别行政区、中国省和日本地区的EV71流行中都曾有报道。其中1998年我国省EV71流行期间急性咽喉炎患者比例较大，达到10%以上。 3. 发病机制与病理

病毒从咽部或肠道侵入，在局部黏膜或淋巴组织中繁殖，并由局部排出，此时可引起局部症状。继而病毒又侵入局部淋巴结，并由此进入血液循环导致第一次病毒血症。病毒经血循环侵入网状内皮组织、深层淋巴结、肝、脾、骨髓等处大量繁殖并由此进入血液循环，引起第二次病毒血症。病毒可随血流进入全身各器官，如中枢神经系统、皮肤黏膜、心脏等处，进一步繁殖并引起病变。

易感者感染EV71后，出现血管变态反应和组织炎症病变。当病毒累及中枢神经系统时，组织炎症较神经毒性作用更加强烈，中枢神经系统小血管内皮最易受到损害。细胞融合、血管炎性变、血栓形成可导致缺血和梗死。在脊髓索、脑干、间脑、大脑和小脑的局部组织中，除嗜神经性作用外，还存在广泛的血管周围和实质细胞炎症。 传染方式

人类是肠病毒唯一的传染来源，主要经由肠胃道（粪-口、水、食物污染）或呼吸道（飞沫、咳嗽或打喷嚏）传染，也可经由接触病人皮肤水泡的液体而受到感染。在发病前数天，喉咙部位与粪便就可发现病毒，此时即有传染力，通常以发病后一周内传染力最强；而患者可持续经由肠道释出病毒，时间长达8到12周之久。潜伏期为2到10天，平均约3到5天。肠病毒适合在湿、热的环境下生存与传播。

肠道病毒EV71感染疾病是由肠道病毒EV71引起的传染病，简称为EV71.

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多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。

该病的潜伏期为2～7天，传染源包括患者和隐性感染者。该病传播方式多样，以通过人群密切接触传播为主。病毒可通过唾液、疱疹液、粪便等污染的手、毛巾、手绢、牙杯、玩具、食具、奶具以及床上用品、内衣等引起间接接触传播；患者咽喉分泌物及唾液中的病毒可通过飞沫传播；如接触被病毒污染的水源，亦可经水感染。

人群对肠道病毒EV71普遍易感，感染后可获得免疫力。由于不同病原型别感染后抗体缺乏交叉保护力，因此，人群可反复感染发病。成多已通过隐性感染获得相应抗体，因此，肠道病毒EV71感染疾病的患者主要为学龄前儿童，尤以3岁以下年龄组发病率最高。

肠道病毒EV71感染疾病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。澳大利亚和美国、瑞典一样，是最早出现EV 71感染的国家之一。1972年肠道病毒71型(EV 71)在美国被首次确认。1972－1973 年、1986年和1999年澳大利亚均发生过EV 71流行，重症病多伴有中枢神经系统症状，一些病人还有严重的呼吸系统症状。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV 71流行，仅保加利亚就超过750例发病，149人致瘫，44人死亡。日本是肠道病毒EV71感染疾病发病较多的国家，历史上有过多次大规模流行。20世纪90年代后期，EV71开始肆虐东亚地区。1997年以来，该病在马来西亚、新加坡等地大规模爆发流行，并发中枢神经系统症状而导致死亡病例增多，引起世界各国关注和警惕。1997年4—8月马来西亚共有2628例发病，4～6月死亡2 9例，死者平均年龄1.5岁。 4. 预防治疗

预防是关键

4.1 就地隔离避免接触。早期发现传染源，凡发现手足口征候的孩子，不要再送托儿所、幼儿园；隔离治疗,分开食宿，用具、玩具应分开；以免感染其他儿童。 4.2 把住病从口入关，防密切接触。EV71感染主要通过唾液、疱疹液、粪便污染的食物和物品密切接触传播，儿童和成人都可能感染。避免粪便、口鼻分泌物污染水与食物，彻底处理好孩子的粪便排泄物，尿布要洗净消毒再用，孩子的奶瓶、食具也要经常消毒。

4.3 养成卫生习惯。教育孩童、学生自幼养成卫生习惯，改掉吮手指的习惯，远离垃圾及不洁环境；养成游戏后、饭前、便后一定彻底洗手的习惯。大人感染后没有症状，成为隐性传染源，更危险。

4.4 强化环境卫生。对幼托机构的环境及玩具、公共游泳池等必须严格消毒。注意粪便无害化处理，绝不允许污染用水。

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第十三章 麻疹病毒的生物危害评估报告

麻疹病毒（measles virus）是麻疹的病原体，分类上属于副粘病毒科麻疹病毒属。麻疹是儿童常见的一种急性传染病，其传染性很强，以皮丘疹、发热及呼吸道症状为特征。若无并发症，愈后良好。我国自60年代初应用减毒活疫苗以来，儿童的发病率显著下降。但在发展中国家仍是儿童死亡的一个主要原因。在天花灭绝后，WHO已将麻疹列为计划消灭的传染病之一。另外发现亚急性硬化性全脑炎（subacute sclerosing panencephalitits，SSPE）与麻疹病毒有关。 1. 致病性

麻疹病毒的唯一自然储存宿主是人。急性期患者是传染源，患者在出疹前6天至出疹后3天有传染性。通过飞沫传播，也可经用具、玩具或密切接触传播。麻疹传染性极强，易感者接触后几乎全部发病。发病的潜伏期为9～12天。由于CD46是麻疹病毒受体，因此具有CD46的大多组织细胞均可为麻疹病毒感染的靶细胞。经呼吸道进入的病毒首先与呼吸道上皮细胞受体结合并在其中增殖，继之侵入淋巴结增殖，然后入血（在白细胞内增殖良好），形成第一次病毒血症。病毒到达全身淋巴组织大量增殖再次入血，形成第二次病毒血症。此时开始发热，继之由于病毒在结膜、鼻咽粘膜和呼吸道粘膜等处增殖而出现上呼吸道卡他症状。病毒也在真皮层内增殖，口腔两颊内侧粘膜出现中心灰白、周围红色的Koplik斑，3天后出现特征性皮疹，皮疹形成的原因主要是局部产生超敏反应。一般患儿皮疹出齐24小时后，体温开始下降，呼吸道症状一周左右消退，皮疹变暗，有色素沉着。有些年幼体弱的患儿，易并发细菌性感染，如继发性支气管炎、中耳炎，尤其易患细菌性肺炎，这是麻疹患儿死亡的主要原因。大约有0.1%的患者发生脑脊髓炎，它是一种迟发型超敏反应性疾病，常于病愈1周后发生，呈典型的脱髓鞘病理学改变及明显的淋巴细胞浸润，常留有永久性后遗症，病死率为15%。免疫缺陷儿童感染麻疹病毒，常无皮疹，但可发生严重致死性麻疹巨细胞肺炎。百万分之一麻疹患者在其恢复后若干年，多在学龄期前出现亚急性硬化性全脑炎（subacute sclerosing panencephalitis，SSPE）。SSPE属急性感染的迟发并发症，表现为渐进性大脑衰退，1～2年内死亡。经研究发现，患者血清及脑脊液中虽有高效价的IgG或IgM抗麻疹病毒抗体，但是用这些抗体很难分离出麻疹病毒。现认为脑组织中的病毒为麻疹缺陷病毒，由于在脑细胞内病毒M基因变异而缺乏合成麻疹病毒M蛋白的能力，从而影响病毒的装配、出芽及释放。因此，将SSPE尸检脑组织细胞与对麻疹病毒敏感细胞（如HeLa、Vero等）共同培养，可分离出麻疹病毒。 2. 免疫性

麻疹病后人体可获得终生免疫力，主要包括体液免疫和细胞免疫，细胞免疫起主要作用。

感染后产生的抗HA抗体和HL抗体均有中和病毒作用，而且HL抗体还能阻止病毒在细胞间扩散，感染初期以IgM为主，而后以IgG1和IgG4为主。细胞免疫有很强的保护作用，如免疫球蛋白缺陷的人患麻疹能够痊愈，并且抵抗再感染；而细胞免疫缺陷的人感染麻疹则极其严重，这表明细胞免疫在机体恢复中

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起主导作用。在出疹初期末稍血中可检出特异的杀伤性T细胞。6个月内的婴儿因从母体获得IgG抗体，故不易感染，但随着年龄增长，抗体逐渐消失，自身免疫尚不健全，易感性也随之增加。故麻疹多见于6个月至5岁的婴幼儿。 3. 防治原则

预防麻疹的主要措施是隔离患者；对儿童进行人工主动免疫，提高机体的免疫力。目前国内外普遍实行麻疹减毒活疫苗接种，使麻疹发病率大幅度下降。我国规定，初次免疫为8月龄，1年后及学龄前再加强免疫。这种疫苗皮下注射，阳转率可达90%以上，副作用小，免疫力可持续10年左右。对未注射过疫苗又与麻疹患儿接触的易感儿童，可在接触后的5天内肌注健康成人全血、麻疹恢复期人血清或丙种球蛋白都有一定的预防效果。 4. 预防

麻疹的预防主要有：

① 加强体育锻炼，提高抗病能力。

② 隔离患者。麻疹传染力强，在流行期间，医疗防疫部门应组织医务人员对患者定期进行家庭访视，做到“病人不出门，医药送上门”，直到出疹后5天。托儿所、幼儿园要设置临时隔离室对患者进行隔离。对接触者应进行隔离观察2～3周；如无症状，才能回班活动。麻疹患者停留过的房间应开门窗通风20～30分钟。医护人员在接触患者后应脱去外衣洗手，或在户外活动20分钟后再接近易感者。

③ 麻疹流行期间尽量少带孩子去公共场所（尤其是医院），少串门，以减少感染和传播机会。

④ 注意个人及环境卫生，不挑剔食物，多喝开水。

⑤ 自动免疫：8个月以上未患过麻疹者均应接种麻疹减毒活疫苗。接种后12天左右可产生免疫力，即使得病，病情也较轻。

⑥ 被动免疫：在麻疹流行期间，对没有接种过疫苗的年幼、体弱易感者，在接触患者5天以内，肌肉注射丙种球蛋白或胎盘球蛋白，可能免于患病或减轻病情。

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第十四章 人类免疫缺陷病毒HIV的生物危害评估报告

人类免疫缺陷病毒（HIV）病毒特异性地侵犯CD4+T淋巴细胞，造成机体细胞免疫受损。临床上初始表现为无症状病毒感染者，继续发展为持续性全身淋巴结肿大综合征和艾滋病综合征，最后并发各种严重机会性感染和恶性肿瘤，成为AIDS，病死率极高。到目前为止，还没有找到一种治愈该病的方法。 1. 病原学

1.1 HIV是单链RNA病毒，属逆转录病毒科，慢病毒属，包括HIV-1型和HIV-2型，两者均能引起AIDS。但多数AIDS乃由HIV-1型引起。HIV既有嗜淋巴细胞性又有嗜神经性，主要感染CD4+T淋巴细胞，也能感染单核巨噬细胞，B细胞和小神经胶质细胞、骨髓干细胞等。 1.2 HIV的抵抗力：HIV对外界抵抗力较弱，对热敏感，56℃30分钟能灭活。25%以上浓度的酒精即能灭活病毒，70%的效果最好；0.2%次氯酸钠、5%～8%甲醛及有机氯溶液等均能灭活病毒。但对0.1%甲醛溶液、紫外线和γ射线不敏感。在实验室条件下，HIV在干燥环境中很快失去活性，在厚血块中可存活十几天，在干燥的玻璃上可维持几天。美国CDC证明干燥环境中的HIV浓度在几小时内降低90%～99%。 2. 流行病学

2.1 传染源：病人和无症状病毒携带者是主要的传染源，前者的传染性最强，后者在流行病学上意义更大。病毒主要存在于血液、精液、子宫和阴道分泌物中；乳汁、唾液、泪水等均能检出病毒。

2.2 传播途径：世界公认的传播途径有三种，即性传播、血液传播及母婴传播。 2.3 人群易感性：各个年龄均可感染，但同性恋和性乱交者，静脉毒瘾者，血友病患者，接受血、血制品或器官移植者，父母是HIV感染者的儿童，受感染的危险性比较大，属高危人群，发病年龄主要为40岁以下的青状年。 3. 临床表现

本病潜伏期较长，HIV-1侵入机体后2～10年左右可以发展为AIDS，HIV-2所需的时间更长。HIV感染人体后分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四期，HIV对CD4+T淋巴细胞有特殊的亲嗜性，发病与HIV含量、毒力、变异及CD4+T淋巴细胞数量、功能和机体免疫状况有关。临床上可表现为原因不明的免疫缺陷，往往以淋巴结肿大、厌食、慢性腹泻、体重减轻、发热、乏力等全身症状起病，逐渐发展至各种机会性感染、继发性肿瘤、精神神经障碍而死亡。 4. 实验模式及危害因素分析

4.1 HIV抗体和抗原检测：最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。HIV的主要传播途径就是血液传播，在进行采样和检测等过程中，都可能接触到血液，

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因此对于未知样品的检测具有潜在危险性；而对于直接接触HIV感染者或艾滋病病人血液和体液时，实验危险性较高，更应注意个人防护。

4.2 HIV核酸检测：样品有全血、血浆、组织和其他分泌物，有时还包括生物制品，此类标本具有潜在危险性，对于HIV感染者或艾滋病病人的样品，实验危险性较高。

4.3 HIV病毒培养：培养物中含大量的HIV，对于实验人员具有相当高的传染危险性。应该在P3实验室内进行操作，同时严格做好个人防护工作。 5. 安全保障措施

5.1 个人防护

5.1.1 高标准的个人保健对于减少感染的危险性很重要。皮肤受损、生病都会增加感染的危险性。皮肤的伤口和擦伤都应以防水敷料覆盖。

5.1.2 进实验室前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以免刺破手套。

5.1.3 进入实验室应穿隔离衣，戴手套。如果接触物传染危险性大，则应戴双层手套和防护眼镜。

5.1.4 离开实验室前必须脱去隔离衣并洗手。

5.1.5 严禁在艾滋病检测实验室内进食、饮水、吸烟和化妆。 5.1.6 减少实验室内利器的使用。 5.2 带入和带出实验室的物品

5.2.1 对所有带入实验室的物品都应进行检查。含有测试样品的包裹应在安全柜或其他适当的装置内打开。

5.2.2 将HIV测试样品转送其他实验室时，应防止对人员和环境的污染。护送样品的人应明确接收地点和接收人，实验室负责人或其指定的人员应及时确认样品已送达指定的实验室，被转入安全位置并得到妥善处理。

5.2.3 污染或可能造成污染的材料在带出实验室前应进行消毒。 5.3 消毒方法

5.3.1 废弃物缸：10%（V/V）次氯酸钠（含10，000ppm有效氯）。 5.3.2 生物安全柜工作台面和仪器表面：70%乙醇。 5.3.3 溢出物：10%次氯酸钠（V/V）。

5.3.4 污染的台面和器具：40%甲醛水溶液，也可以用过氧化氢或过氧乙酸

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第十五章 乙型脑炎病毒的生物危害评估报告

1. 危害程度分类

（一）分类等级

流行性乙型脑炎是经蚊虫媒介传播的一种人畜共患性疾病。1935年日本的学者从病死脑炎病人的脑组织中分离到该病毒，国际上，将这种病原体命名为日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）,简称“乙脑病毒”。我国称为“流行性乙型脑炎”，简称“乙脑”。根据《中华人民共和国传染病防治法》，流行性乙型脑炎属于乙类传染病。

根据2006年卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》，乙脑病毒属于危害程度第二类的病原微生物。运输包装为A类，UN编号：UN2814。

（二）不同实验室操作生物安全实验室级别要求 检验地带网

根据《名录》的要求，在实验室操作可能含有和确定含有乙型脑炎病毒感染性材料或未经培养的感染性材料以及病毒培养、动物感染实验，务必在BSL—2实验室内进行；在对灭活、无感染性材料进行操作时，确认的乙脑病毒灭活措施有效后，方可进入BSL—1实验室进行诸如ELISA，PCR等后续实验检测过程。 2. 一般生物学特性

形态染色：乙型脑炎病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）, 黄病毒属（flavi—virus）。电镜下病毒颗粒大致呈球形，直径40~60nm左右。超薄切片上可看到一层外膜（膜蛋白囊膜）和一个电子密集的核心（RNA蛋白），围绕成一个清晰的结构。负染色体可见一些明显的突起部分分布在外膜上，由32个子粒组成的衣壳呈明显的对称二十面体。病毒基因组为11kb左右的单股、正链RNA。脂质双分子层中镶嵌有糖基化的包膜蛋白（E）和膜蛋白（M）。在脂蛋白囊膜表面有血凝素刺突，能凝集鸡、鹅、羊等动物红细胞。JEV抗原性稳定，人和动物感染JEV后，均产生补体结合抗体、中和抗体和血凝抑制抗体。

培养特性：JEV能够感染多种细胞，C6/36、BHK21、Vero等细胞株和金黄色地鼠肾、猪肾、狗肾、鸡胚等原代细胞均对乙型肝炎病毒敏感，并引起典型的细胞病变。较敏感的细胞包括金黄色地鼠肾细胞，猪肾细胞。上述细胞感染乙型脑炎病毒后均能够大量繁殖扩增到增到较高的滴度，并引起明显的细胞病变，细胞病变表现为细胞圆缩，脱落：C6/36细胞上的病变可以表现为聚集、圆缩以及脱落等。在琼脂糖覆盖下，鸡胚、地鼠肾、Vero等细胞均能形成蚀斑。本病毒的这一特性可用于减毒疫苗苗株的筛选。 检验地带网

乙型脑炎病毒有明显的嗜神经特性，接种小鼠、金黄色地鼠、猴、马、绵羊、山羊等动物内均可引起典型的神经系统症状，乳鼠可经皮下接种而感染，小鼠是常用的实验动物模型。能凝集多种动物血红细胞。病毒在细胞和鼠脑内连续传代，可使毒力下降。

（1）原代细胞：原代细胞较敏感。而常用的为黄金色地鼠肾细胞（BHK-21）。培养环境：含EagLe’s液、胎牛血清、青霉素和链霉素（PS）、1%谷氨酰胺（G）

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的生长维持液；ph值至7.2~7.4；37℃5%CO2培养箱孵育。以小量病毒（10TCID50）感染后，病毒很快繁殖，24H开始出现病变，72H病变明显，病毒滴度可达107TCID50/ml以上。其他常用细胞有鸡胚纤维母细胞，常用于蚀斑培养。

（2）传代细胞：以白蚊伊蚊C6/36细胞为最敏感，培养环境：含EagLe’s液、10培养液、胎牛血清、青霉素和链霉素（PS）、1%1%谷氨酰胺（G）的生长维持液；ph值至7.2~7.4。在28℃的5% CO2培养箱孵育。病毒反之滴度高达108TCID50/ml，但细胞病变不甚明显。BHK-21细胞可用于培养，也可适用于做蚀斑，此外，人二倍体细胞也可培养病毒。不同细胞的敏感性不同。 3. 乙脑病毒对外环境的稳定性

1.自然环境中的稳定性与对温度的敏感性：乙型脑炎病毒对外界抵抗力弱，不耐热，50℃30min或℃10min即可灭活，对低温和干燥抵抗力较强，在4℃冰箱中能保存数年，如加甘油或血清保存可增加其稳定性。病毒感染性在PH7~9时最为稳定，在-70℃或冷冻干燥4℃存放较为稳定，存于4℃的患者血清或其他感染材料的感染性可保持数周之久。

2.对紫外线、生物试剂的敏感性：超声波（560千周/S）、紫外线可灭活病毒。毒粒经蛋白酶处理，不仅可以灭活，且表面突出物及血凝素也全部消失。病毒在不同的稀释剂内的稳定性有明显的不同，如10%水解乳蛋白和5%乳糖是较好的稀释剂。

3.化学因子的敏感性：乙型脑炎病毒属于有包膜的RNA病毒，对乙醚、氯仿、蛋白酶、乳酸、高锰酸钾、龙胆紫等均可灭活病毒。 4. 乙型病毒的致病性和感染数量

1.致病性：当携带乙脑病毒的蚊虫叮咬宿主时，病毒随蚊虫的唾液进入人体内。首先在局部的毛细血管内皮细胞和局部淋巴组织的细胞中增殖，然后病毒释放入血形成短暂的低水平的病毒血症期，病毒经过血液循环扩散到肝、脾等处的细胞中增殖，一般仅表现出轻微的症状或无症状。乙脑病毒通过附着于人体的中枢神经的血管内皮细胞，内吞作用下进入细胞内囊泡中，进而被血管周围的细胞摄取并运送至中枢神经系统。尤其在血脑屏障受损或脑实质已被病毒入侵时更容易诱发脑炎。经过4~7D的病毒增殖过程，大量病毒再次释放入血形成第二次病毒血症，引起发热、寒战、出疹和其他全身不适的症状；乙脑病毒能够导致严重的中枢神经系统病理改变，表现为：可引起脑实质广泛病变，以大脑皮质、脑干及基底核的病变最为明显；脑桥、小脑和延髓次之，脊髓病变最轻。其基本病理改变为：①血管内皮细胞损害，可见脑膜与脑实质小血管扩张、充血、出血及血栓形成，血管周围套式细胞浸润；②神经细胞变性坏死，液化溶解后形成大小不等的筛状软化灶；③局部胶质细胞增生，形成胶质小结。部分患者脑水肿严重，颅内压升高或进一步导致脑疝。病后免疫力强而持久，罕有二次发病者。

多种动物敏感对乙型脑炎病毒，将乙型脑炎病毒颅内接种小白鼠、金黄色地鼠、马、绵羊、山羊、马等都能够发生典型的神经系统症状和病理改变。一般颅内接种3日龄乳鼠，2~3D内病变达到最强表现为死亡，首先表现为离群、抽搐、拒乳、行动迟缓、后肢活动障碍、平衡能力下降，中枢神经系统症状渐进性发展最终对外界刺激反映能力下降或消失、体温下降直至死亡，通常皮下方式接种21日龄以下的小白鼠，致病变作用明显，病毒先在神经组织繁殖，再通过血脑屏障侵入神经组织，引起脑炎而死亡。

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2.感染数量：目前尚无乙脑对人的感染剂量的相关报道 5. 乙脑病毒的传播途径及暴露的后果

1.自然状态下乙脑的传播途径：乙脑属于血液传播的自然疫源性疾病。病毒通常在猪—蚊—猪之间循环。通过媒介昆虫叮咬处于病毒血症的动物，乙脑病毒在昆虫体内增殖，再叮咬人，通过口器把病毒传到人体而引起感染发病。乙脑的传染源是受感染的动物和人。动物：主要是猪，其次为家鼠、猴、马、牛、羊、兔、田鼠、仓鼠、鸡、鸭以及鸟类等。猪成为主要传染源，蚊虫是乙脑病毒的最主要的扩散宿主和传染源。

2.实验室操作所致的非自然状态下乙脑感染途径：实验室操作可能发生感染的途径主要有：大量活病毒操作时形成的感染性气溶胶传播、开放型伤口等。气溶胶的产生环节包括：离心、病毒悬液分装、病毒培养换液以及实验动物标本注射、标本解剖等环节。开放型伤口感染模式主要发生在：实验动物接种与实验动物解剖过程中注射器针头或破裂的病毒培养瓶扎伤、划破；被实验室内感染有病毒的 齿动物咬伤；破损的皮肤或黏膜组织接触到病毒等造成意外胃肠外接种等环节。

目前，尚没有实验研究人员在实验室内感染乙脑病毒而致病的相关资料记载或报道，在实验室内通过上述途径是否引起乙脑病毒的隐性感染也未经研究报道证实。因此，提示实验研究人员特别注意严格遵守生物安全实验室的有关规定规范，防止“实验室内感染”。

3.暴露后果：病毒经蚊叮咬侵入人体，病毒初在单核巨噬细胞内繁殖，再释放入血，多数人在感染后并不出现症状，但血液中抗体可升高，出现无症状或轻微全身症状的隐性感染，而获得了免疫。仅有少数人体内，病毒可通过血脑屏障，进入中枢神经系统而发生脑炎，出现中枢神经系统症状。兵变以脑实质炎症为主。神经细胞呈广泛变性和坏死，脑组织充血、水肿，血管周围有炎性细胞侵润，胶质细胞增生。较重病例，脑组织有软化灶形成。虽脑炎病变分布广泛，但以大脑皮质、中脑、丘脑和延脑病变较重。因延脑呼吸中枢受损，或由于大脑皮质、下丘脑、桥脑病变抑制了呼吸中枢的功能，可产生中枢性呼吸衰竭。由于脑实质炎症，一般均有颅内压增高症；严重者可形成脑疝，影响呼吸、循环中枢，如不积极抢救治疗，很快就可死亡。由于病变程度和分布各有不同，故在临床上神经症状表现极不一致。严重脑组织的破坏是产生后遗症的主要原因。

潜伏期为4~15D，一般为10~14D。表现为高热（可达40℃以上）、头痛、呕吐、意识障碍、惊厥或抽搐、呼吸衰竭等症状，病程在1~2周以上。症状轻者可以完全康复，30%~50%会留有严重的后遗症。成人多数呈隐性感染，发病多见于10岁以下儿童，因其血脑屏障功能薄弱，病毒易于从血液进入，尤以2~6岁儿童发病率最高。孕妇在妊娠早期感染可以通过胎盘传播给婴儿导致死胎、流产或畸形。在发病一周后，病人体可出现中和抗体能够中和JEV的感染能力，所以少有第二次发病者。有报道称JEV感染人存在慢性持续性感染，并不表现出明显症状。

6. 乙脑病毒的宿主范围和媒介

乙脑的传染源是受感染的动物和人。动物：主要是猪，其次为家鼠、猴、马、牛、羊、兔、田鼠、仓鼠、鸡、鸭以及鸟类等。猪成为主要传染源，是由于猪的乙脑感染率高，成幼猪均可感染，更新换代快、数量多，与人的关系密切，且多

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种蚊虫有兼吸猪和人的血的习性，是乙脑病毒的最主要的扩散宿主和传染源。国内外有许多学者和防疫人员，用猪的感染率预测乙脑发病主的指标。人受感染后，经1~5D，出现病毒血症，成为传染源。但由于人体出现病毒血症期短，且血液中病毒滴度不高，所以，病人非主要的传染源。蚊虫是乙脑病毒的传播媒介，已经证实多种蚊在体内繁殖乙脑病毒，包括库蚊属，伊蚊属，按蚊属中的许多种，其中最为主要的是三带喙库蚊对乙脑病毒的感染阈值低，感染高，有兼吸动物（主要是猪）和人血的习性，且该种蚊分布普遍。同时蚊虫也是本病毒重要的长期储存宿主，越冬蚊可带病毒过动到第2年，从蚊卵、蚊幼虫体亦可分离出病毒。另外，国内从蠛蠓和库蠓中分离到乙脑病毒，在日本和我国地区曾多次从蝙蝠中分离到乙脑病毒，蝙蝠经蚊叮咬后可出现长达6D的病毒血症，但不发病，因此，认为蝙蝠、蠛蠓和库蠓亦成为乙脑的传播媒介，我国曾从蝙蝠和蠛蠓分离到乙脑病毒。

7. 乙脑的预防、诊断和治疗

1.预防

（1）免疫接种：接种乙脑疫苗以提高人群免疫力是预防乙脑的重要措施之一。接种对象是流行区的儿童及从非流行区到流行区的敏感人群。目前有灭活疫苗和活疫苗两种。为了确保疫苗接种效果，接种时间应在流行季节前1~3个月完成。儿童初次基础免疫后应按规定加强免疫。疫苗在运输和储存过程中均应在4℃保存。以保证其有效性。

我国目前广泛使用的乙脑疫苗有地鼠肾灭活疫苗和地鼠肾减毒活疫苗。目前已研制出纯化浓缩的灭活疫苗。我国的乙脑减毒活疫苗自19年批准生产以来，10年多共生产两亿多人份，接种约1亿多人，实验观察副反应较轻，认为是安全有效的，但免疫持久性有待进一步观察。

（2）灭蚊防蚊：灭蚊、防蚊为预防本病的主要环节。针对传播乙脑病毒的蚊虫所采取的以环境智力为主的综合防制措施是切断法。宜开展以灭蚊为中心的群众性爱国卫生运动，在农村重点是消灭牲畜（特别是猪圈）的蚊虫。黄昏户外活动应避免蚊虫叮咬。

（3）化学药物等防制：在我国现阶段，采用化学防制方法也是最重要的手段，对一时无法清除的孽生地，可使用灭幼虫杀虫剂定期喷洒，如20%清氛杀虫乳油、生物蛙、必克幼、2%吡虫啉灭幼颗粒剂等药物，效果较好。尤其在发生蚊媒传染病的疫区，使用化学药物，迅速降低成蚊密度是当务之急，通过化学药物的空间喷雾和滞留喷洒达到成蚊防制。

（4）实验室防护：针对前述可能出现实验室感染的环节：离心时，使用带盖的密封离心机；严格按照生物安全操作规范，病毒培养操作时，要求实验操作务必轻柔规范，并且要求使用负压设施；实验操作过程中，佩戴符合生物安全标准的防护器材包括：口罩、帽子、手套和隔离衣等；定期进行生物安全耗材的评价、评估工作；进行动物实验，务必小心，警惕不要被锐器扎伤，动作轻柔最大限度地减少气溶胶产生的可能性。

2.诊断：根据流行病学资料、临床症状和体征以及实验室检查结果的综合分析进行诊断，但确诊则需要依靠抗体检查或病原分离。

（1）流行病学：在乙脑流行区居住，在蚊虫叮咬季节发病或发病前25D内在蚊虫叮咬季节到过乙脑流行区。

（2）临床症状和体征：急性起病，发热头痛、喷射性呕吐、嗜睡，伴有脑

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膜刺激症状。

急性起病，发热2~3D后出现不同程度的意识障碍，如昏迷、惊厥、抽搐、肢体痉挛性麻痹等中枢神经系统症状，或发展至中枢性呼吸循环衰竭。

（3）实验室检查

1）血象：白细胞增高及中性粒细胞增加。

2）脑脊液：压力增高，呈非化脓性炎症改变（外观清亮，蛋白轻度增高，糖与氯化物正常，白细胞增高，多在50~500×106/L，早期多核细胞为主，后期单核细胞为主。

3）血清学试验：补体结合试验：多在发病第3周才出现阳性，故对早期诊断意义不大。多采取双份血清，即初期及恢复期各一份，如第 2次血清补体结合抗体效价上升4倍以上，即为阳性。

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