DNA/RNA提取试剂盒操作注意事项

AllPure?DNA/RNA?Kit?

DNA/RNA提取试剂盒说明书?

?Cat.?No.? ? K0590? ?

? ?保存：室温?

组分说明?

Cat.?No.? K0590?

?

Kit?Size? 50?

? Buffer?RL? 35?ml?

Buffer?RW1? 40?ml?

? Buffer?RW2（concentrate）? 11?ml?

RNase-Free?Water? 10?ml?

?

Buffer?GW1（concentrate）? 13?ml?

? Buffer?GW2（concentrate）? 15?ml?

Buffer?GE? 15?ml?

?

Spin?Column?DM? 50?

? Spin?Column?RM? 50?

Collection?Tube（1.5?ml）? 100?

? Collection?Tube（2?ml）? 150?

产品简介?

本试剂盒可用于从同一细胞或组织样本中同时纯化基因组 DNA 和总 RNA。由于不需要将样本分成两份用于不同的纯化步骤，该试剂盒可最大限度的回收 DNA 和 RNA。纯化的 DNA 和 RNA 被单独洗脱并可直接用于各种下游实验。本试剂盒中不包含苯酚和氯仿等有毒物质，无需乙醇沉淀，操作简单、快捷。基因组 DNA 可用于 PCR、Real-time?PCR、Southern?Blot、Dot?Blot、比较基因组杂交（CGH）、基因分析和 SNP 分析；总 RNA 可用于 RT-PCR、Real-time?RT-PCR、cDNA 的合成、Northern?Blot、Dot?Blot 等分析。?

注意事项?

1. 预防RNase污染，应注意以下几方面：?

1?)? 使用无RNase的塑料制品和头，避免交叉污染。?

2?)? 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5?M?NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。?

3?)? 配制溶液应使用RNase-Free?Water。?

4?)? 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。?

2. 样品应避免反复冻融，否则影响提取DNA和RNA的质量。样品在Buffer?RL中，可于-70℃保存一个月。?

3. Buffer?RL在使用前请加入β-巯基乙醇，1?ml?Buffer?RL加10? μl? β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer?RL室温可保存1个月。?

5. 使用前请检查 Buffer?RL 是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请于 56℃水浴重新溶解。?

6. 所有离心步骤均使用台式离心机，室温下进行。?

自备试剂：β-巯基乙醇（新开封或提取 RNA 专用）、70%乙醇（用无 RNase 的水配制）、无水乙醇?

操作步骤?

1. 材料处理?

? ? ? ? 1a.? 贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液（最大提取量为107个细胞）,? 收集细胞，弃尽培养液，加入600?μl?Buffer?RL（用前检查是否加入β-巯基乙醇），反复吹打使其充解。?

注意：一定要弃尽培养液，否则影响裂解和后续的核酸纯化步骤。?

? ? ? ? 1b.? 取不大于30?mg的动物组织，液氮研磨成细粉末，加入600?μl?Buffer?RL（用前检查是否加入β-巯基乙醇），或直接加入600?μl?Buffer?RL（用前检查是否加入β-巯基乙醇），匀浆处理。?

? ? ? ? 注意：匀浆要充分，否则影响RNA产量。?

2. 将上步所得溶液12,000?rpm（～13,400×g）离心3-5分钟，小心的将上清加入到已装入收集管（2?ml?Collection?Tube）的吸附柱（Spin?Column?DM）中，12,000?rpm离心30-60? 秒，收集滤液。将吸附柱DM放在一个新的2?ml收集管

（2?ml?Collection?Tube）中，室温或4℃放置，待提DNA。?

注意：确保吸附柱? DM上没有液体残留，如果有必要可以重复离心，直至所有的液体通过吸附柱DM的膜。总RNA提取?

3. 向步骤2所得滤液中加入1倍体积的70%乙醇（无RNase的水配制），混匀。?

4. 将上步所得溶液全部加入到已装入收集管（2?ml?Collection?Tube）的吸附柱（Spin?Column?RM）中，若一次不能全部加完溶液，可分次转入。12,000?rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RM重新放回2?ml收集管中。?

5. 向吸附柱RM中加入700? μl?Buffer?RW1,?12,000?rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RM重新放回2?ml收集管中。?

6.向吸附柱RM中加入500? μl?Buffer?RW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）,12,000?rpm离心20秒,? 倒掉收集管中的废液，将吸附柱RM重新放回2?ml收集管中。?

7. 重复步骤6。?

8. 12,000?rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱RM置于室温数分钟，以彻底晾干。?

注意：此步骤目的是去除吸附柱RM中残余的乙醇，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。?

9. 将吸附柱RM置于一个新的无RNase1.5?ml离心管（Collection?Tube?1.5?ml）中，向吸附柱RM的中间部位加入30-50?μl?RNase-Free?Water，室温放置2-5分钟，12,000?rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。?

注意：1）RNase-Free?Wate体积不应小于30? μl，体积过小影响回收率。?

? ? ? ?2）如果要提高RNA的产量，可用30-50? μl新的RNase-Free?Water重复步骤9。?? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤9。?

基因组DNA 提取?

10. 向吸附柱 DM 中加入 500? μl?Buffer?GW1（使用前检查是否加入无水乙醇）,?12,000?rpm 离心 20 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 DM 放回 2?ml 收集管中。?

11. 向吸附柱DM中加入500? μl?Buffer?GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）,?12,000?rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱DM放回2?ml? 收集管中。

12. 12,000?rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱DM置于室温数分钟，以彻底晾干。?

注意：这一步的目的是将吸附柱DM中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。?

13. 将吸附柱DM置于一个新的无RNase?1.5?ml离心管（Collection?Tube?1.5?ml）中，向吸附柱DM的中间部位加入?100? μl?Buffer?GE，室温放置2-5分钟，12,000?rpm离心2分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。?

注意：1）Buffer?GE的体积不应小于100? μl，体积过小影响回收率。?

? ?2）如果要提高DNA的产量，将100? μl新的Buffer?GE加至吸附柱上，重复步骤13。?

3）如果要提高DNA浓度，可以将步骤15所得的DNA洗脱液重新加至吸附柱上，重复步骤13。?

附表 1? 吸附柱 DM 和吸附柱 RM 的规格说明?

规格? 吸附柱 DM? 吸附柱 RM?

最大结合能力? 100?μg?DNA? 100?μg?RNA?

最大加样量? 700?μl? 700?μl?

结合核酸分子量? DNA15–30?kb? RNA>200 核苷酸?

最小洗脱体积? 100?μl? 30?μl?

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