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第２１卷第２期 能源环境保护 Ｖｏ１．２１，Ｎｏ．２ ２００７年４月 ＥｎｅｒｇｙＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｐｒ．，２００７ 染色法 一种改进的丛枝菌根孢子密度 快速测定方法六 毕银丽，吴王燕 （中国矿业大学（北京）资源与安全工程学院，北京１０００８３） 摘要：茵根是目前应用于煤矿区生态治理的一种新技术，菌根孢子密度是衡量菌根生态适 应性的标准之一。采用改进的曲利本兰染色方法，对孢子密度测定方法作了改进，以提高 测定的精度和速度。结果表明：经染色后的基质中孢子及其茵丝呈紫色，在双目显微镜下 观测孢子的数量和形态很容易识别，计数的精度和速度明显提高，降低了孢子密度测定过 程中的人为误差。为检验茵根技术在野外大规模的生态应用效果提供了一种快速测定方 法。 关键词：丛枝菌根；孢子密度；染色法；快速测定 中图分类号：Ｘ１７１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—８７５９（２００７）０２一ＯＯＯ９—０３ ＤＹＥＤ Ｇ Ｍ ＴＨＯＤ—Ａ Ｋ肿ＯＦ咖Ｍ ＴＨＯＤ ＦＯＲⅣｎ ＣＯＲ． ＲⅢＺＡＬ ＳＰＯＲＥ ＤＥＮＳＩＴＹ ＱＵＩＣＫ ＩＭＰＲＯＶＥＤⅣⅢＡＳＵＲＥＭＥＮＴ ＢＩ Ｙｉｎ—ｌｉ．ＷＵ Ｗａｎｇ—ｙａｎ ｆ Ｓｃｌｉｏｏｌ ｏｆＳａｌｔｙ ａｒｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＭｉｎｉｇｎ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｎｇ，１ｏｏｏ８３） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｏｎ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏａｌ ｍｉｎｅ ａｒｅａｓ．Ｓｐｏｒｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｎａｄａｒｄｓ ｔｏ ｓｃａｌｅ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｅｃｏｌｏｇｙ．Ｄｙｅｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｐｏｒｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｙｅｉｎｇ ｓｐｏｒｅｓ ｉｓ ｐｕｒｐｌｅ，ｅａｓｉｅｒ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｗｉｔ｝１ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｃｅｔ ｉｓ ｏｂｖｉｏｕｓ．Ｉｔ Ｃａｎ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｐｏｒｅ ｄｅｎｓｉｙｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｅｄ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｍａｎ—ｍａｄｅ ｅｌＴｏｒ ｄｕｒｉｎｇ ｍｅａ－ ｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｑｕｉｃｋ ｗａｙ ｔｏ ｔｅｓｔ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｒｂｕｓｃｕｌｒａ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｓ；ｓｐｏｒｅ ｄｅｎｓｉｙｔ；ｄｙｅｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ；ｕｑｉｃｋ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ 丛枝菌根真菌是自然界中普遍存在的一种土 繁殖体。根据ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅ，ｄｅｎ等乜 最新的研究成 壤微生物（简称ＡＭ）。陆地９０％以上的有花植物 果，自然生态系统中菌根真菌影响植物种群的竞争 都能够与它形成菌根共生体，菌根对煤矿区生态 能力，菌根真菌的多样性决定着植物的生物多样 修复具有明显的生态效应ｎ 。丛枝菌根真菌由菌 性、生态系统的变化以及植物的生产力。各种生态 根孢子（果）、丛枝体、泡囊、菌丝组成，都可以作为 因子均不同程度地影响着ＡＭ真菌的分布、侵染、 产孢及其生理效应［３￣引，尤以土壤因子对丛枝菌根 收稿日期：２００６—１０—０８，修改稿：２００７—０１—２６ 的影响最为突出Ｂ】ｏ孢子不仅是作为丛枝菌根真菌 国家自然科学基金（４０２０１０５１和２０３７７０５１）、“８６３”（２００６ＡＡ０６Ｚ３７２） 营养储存的器官，也是一种稳定的繁殖体，它的形 和支撑计划（２００６ＢＡＣ０９Ｂ０３）资助。 第一作者简介；毕银丽（１９７１一），女，陕西米脂人，博士，副教授，主 态特征目前仍是丛枝菌根真菌分类学的重要依 要从事微生物（主要是茵根）在矿区生态重建方面的研究。 转载
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毕银丽等染色法——一种改进的丛枝菌根孢子密度快速测定方法 １Ｏ． 据。选用丛枝菌根真菌孢子作为接种源，不仅可以 得到单一的菌根，而且也可以通过菌根真菌孢子的 萌发来了解菌根真菌对外界条件的适应程度。因 此，适生的菌根真菌孢子的筛选和分离对于研究菌 剖显微镜下观察。 方法二：改进的湿筛倾析法一湿筛倾析染色 法（简称染色法） 前四步骤同方法一。 根真菌孢子在土壤中的分布、存在数量和种类以及 研究菌根在煤矿区生态恢复的适应性具有重要的 意义。目前孢子收集的方法主要有湿筛倾析法、柱 （５）用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲 洗到一个清洁的试管内，滴加曲莉苯蓝染色剂，放 在９０％水浴锅或烘箱中加热０．５ ｈ，进行染色。 析法、漂浮法和离心法，但是常用的方法仍是湿筛 倾析法和离心法 ｌ０这些方法的共同点都是能够将 菌根孢子从生长基质中富积起来，但是孢子与基质 的小颗粒特别是沙粒颜色相近，不易于辨别。本文 将通过改进孢子筛选方法来快速测定孢子密度，达 到大批量样品菌根孢子密度快速测定的目的。 １ 试验材料和方法 １．１ 试验材料 野外采集的土样。样品来源于宁夏煤矸石山 和神东生态恢复试验地，采用随机采样的方法，分 别采集接种菌根处理的根际土样和不接种处理的 对照根际土样共４Ｏ个，基质为沙土。 １．２试验方法： 方法一：湿筛倾析法ｎ］，具体方法为： （１）称取一定重量的土壤标本，放在容器内用 水浸泡２Ｏ～３０ ｍｉｎ，使土壤松散。如果土壤粘性很 大，也可加入各种土壤分散剂。 （２）选用一套洁净的、具有孔径为０．５～０．０３４ ／－ｔｍ的土壤筛，按孔径由大至小的』ｆ莎 从上到下依次 叠放，最底层用一固体物垫着，使筛面稍微倾斜； （３）用玻璃棒搅动浸泡土壤的水溶液，停置几 秒钟后，使大的石砾和杂物沉淀下去，然后将悬浮 的土壤溶液慢慢地倒在最上一层的土壤筛上，倾 倒时，集中倒在筛面的一个点上，避免整个筛面都 沾有土壤溶液； （４）用清水依次轻轻冲洗停留在筛面上的筛 出物，以免在上层粗筛面的剩留物中残留有丛枝 菌根真菌孢子，用洗瓶将停留在筛面上的筛出物 轻轻冲洗到一个清洁的培养皿里面； （５）用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲 洗到一个清洁的培养皿里面，再将滤液通过细筛 并用水冲洗。在冲洗下来的筛出物中，除了有许 多细的沙砾和杂质外，就含有ＶＡ菌根真菌钓不 同直径的孢子。 （６）将含有筛出物的培养皿放在双目实体解 （６）将染色后的滤液通过细筛，并冲洗筛上的滤 物，可洗去染色剂，将筛出物放在清洁的培养皿里。 在冲洗下来的筛出物中，除了有许多细的沙砾和杂 质外，就含有ＶＡ菌根真菌的不同直径的孢子。 （７）将含有筛出物的培养皿放在双目实体解 剖显微镜下观察，可观测到紫色孢子。 ２ 试验结果 （１）两种方法对菌根孢子的形态特性以及测 定精度比较 利用两种不同的方法来观测菌根孢子的形态特 性，发现有明显的区别。常规的湿筛倾析法，在双目 实体解剖显微镜下观测到孢子呈棕黄色（图１），在根 段周围分布更多，菌丝量较大，且孢子颜色与沙粒接 近。而利用染色法观测到孢子呈紫色（图２），菌丝同 时也被染色，与周围沙粒颜色反差较大，孢子从形态 特Ｉ生上观测比较明显，孢子的识别更是一目了然。 以本试验样品为例，本试验条件下以传统的 湿筛倾析法来统计孢子密度，１０ ｇ沙土样品孢子 数平均为３５０个。而利用染色法来测定相同样品 的孢子数平均为３８０个。每个土壤样品精度上平 均提高了８％，染色法较常规的湿筛清析法更易 于识别和辨认，提高了孢子密度测定的精度。 图ｌ 湿筛倾析法观测到的穗子形态（棕黄色） 中国科技论文在线
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第２ｌ卷第２期 能源环境保护 ・ｌｌ・ 色、金黄、红棕和黑色等颜色哺 ，许多孢子的颜色 与基质沙土的颜色相近，在计数时很不易分辨出 来而造成计数误差。通过湿筛倾析法筛选出的菌 根孢子或多或少带有菌丝，因此菌根孢子很容易 在染色剂作用下着色，呈紫色（图２）。在显微镜下 观测孢子的数量，效果明显，易于识别，同时降低 了孢子密度测定过程中的人为误差，提高了孢子 密度测定的精度，染色后的孢子（紫色）比没染色 的孢子（棕黄色）明显易于观测到孢子，可以明显 提高工作效率。染色法与常规的湿筛倾析法相比， 仅多了染色一个环节，但是操作简单可行且染色 多样品可以一次完成，耗时少。 但是该方法与常规的湿筛倾析法相比，也存在 不足，经过在９０ｑＣ水浴锅或烘箱里加热３０ ｍｉｎ染 图２ 染色法观测到的孢子形态（紫色】 色后的孢子失去了活力变成了死孢子，孢子不能再 （２）两种方法对孢子密度测定速度的比较 发芽被利用，因此该方法用于大规模测定孢子密度 利用常规的湿筛倾析法测定孢子密度，本试 是快速可行的，而用于收集活孢子则不适合。 ｎ来计数完成一个样品 ｇ土３５０个孢子）。而利用染色法则需要花费 参考文献： ｍｉｎ来计数完成１个样品（１０ ｇ土３８０个孢 ［１］毕银丽，吴福勇，武玉坤．丛枝菌根在煤矿区生态重建中的应 用［Ｊ］，生态学报，２００５，２５（８）：２０６８～２０７３． ｎ），本试验４０个土样，在测定速度上节约１ 【２ Ｊ Ｖａｎ Ｊ，Ｋｌｉｒｏｎｉｍｏｓ Ｎ，Ｕｒｓｉｃ Ｍ，Ｓａｎｄｅｍ Ｉ．Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇａｌ ｄｉ－ ｖｅｒｓｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｐｌｎａｔ ｂｉｄｅｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃ－ ２００ ｍｉｎ，即２０ ｈ。４０个样品在染色过程中 ｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ。１９９８，３９６（５）：６９～７２． ｍｉｎ，耗 ［３］刘润进，李晓林．丛枝菌根及其应用［Ｍ］．北京：科学出版社． ２０００，９３～９７，１４８～１６９． ［４］石兆勇，陈应龙，刘润进．菌根多样性及其对植物生长发育的 重要意义［Ｊ］．应用生态学报。２００３，１４（９）：１５６５～１５６８． ［５］盖京萍，刘润进．土壤因子对野生植物ＡＭ真菌的影响［Ｊ］． 应用生态学报，２００３，１４（３）：４７０～４７２． 讨论 ［６］李晓林，冯固．丛枝菌根生态生理［Ｍ］．北京：华文出版社． ２００１，２８５，２３～２５． 由于孢子是菌根生态分类的主要依据。孢子 ［６］Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ Ｊｗ，Ｎｉｃｏｌｓｏｎ ３３－Ｉ．Ｓｐｏｒｅｓ ｏｆ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｅｎｄｏｇｏｎｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｂｙ ｗｅｔ ｓｉｅｖｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｃａｎｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓ Ｂｒ Ｍｙｃｏｌ Ｓｏｃ， １９６３．４６：２３５～２４４． 妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇妇 迎订阅 ● 投稿 ● 刊登广告！ 带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带带 验条件下需要４５ ５０ ｍｉ（１０ ２５—３０ 子），测定速度上１个样品缩短了一半时间（２５．３０ ｍｉ０００—１可以一次在水浴锅或烘箱中进行染色３０ 时少，因此利用该染色法能够极大地提高孢子密 度测定的速度，为大规模样品的孢子密度监测提 供了一种快速的方法。尤其对于初学菌根技术的 人更是一种可行的快速测定方法。３在土壤中主要呈无色透明、白色、淡黄、黄棕、棕
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