基于均匀试验设计优化美拉德反应产物抑菌性能的研究

章银良; 李鑫; 蔡亚玲

【期刊名称】《《河南工业大学学报（自然科学版）》》 【年(卷),期】2019(040)004 【总页数】6页(P17-22)

【关键词】均匀试验设计; 美拉德反应产物; 抑菌圈; 抑菌活性 【作 者】章银良; 李鑫; 蔡亚玲

【作者单位】郑州轻工业大学食品与生物工程学院 河南郑州450001; 郑州轻工业大学食品生产与安全河南省协同创新中心 河南郑州450001 【正文语种】中 文 【中图分类】TS201.2 0 引言

美拉德反应是一种广泛存在于食品加工过程中的非酶褐变反应[1]。大量研究表明，美拉德反应产物（Maillard Reaction Products,MRPs）具有着色、抑菌、抗氧化等性质[2]，它不仅影响食品的风味、色泽和营养价值，其产生的类黑精、还原酮及一系列含氮、硫的挥发性杂环化合物还会赋予产物良好的抗氧化活性和抑菌活性[3]。

现今，国内外食品科研工作者对MRPs 的体外抗氧化活性进行了大量的研究，发现其具有良好的自由基清除能力、还原能力和金属螯合能力等。然而，却很少见关

于MRPs 抑菌防腐性能方面的研究。因此，本研究分别选取4 种糖（木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖）和4 种氨基酸（甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸）两两组合，通过抑菌试验测定比较抑菌圈直径来探讨其抑菌活性的大小，从而筛选出分别对细菌、真菌抑菌活性较强的美拉德反应组合。然后分别以两种常见指示菌酵母菌、大肠杆菌的抑菌圈直径为指标，再将其组合通过一系列单因素试验和均匀试验设计对其反应条件中的4 个因素（物质的量比、pH 值、温度、时间）进行优化[4]，确定具有最佳抑菌活性的反应条件组合。本研究为开发具有独特防腐效果的MRPs 提供了一定的理论依据和数据参考。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂

L-赖氨酸、L-精氨酸、甘氨酸、组氨酸、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖：Solarbio 试剂公司；生化试剂；蛋白胨、氯化钠、酵母粉、琼脂: 北京奥博星生物技术有限公司；无水乙醇（分析纯）：国药集团有限公司；去离子水。大肠杆菌、酵母菌受试菌株来自本校实验室。 1.2 仪器与设备

LX-C35L 立式自动电热压力蒸汽灭菌器：合肥华泰医疗设备有限公司；SQP 电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HJ-3 恒温磁力加热搅拌器：常州国华电器有限公司；pH 计：瑞士梅特勒-托利多公司；HH -1 智能型数显恒温油浴槽：巩义市予华仪器有限责任公司；HH 恒温水浴锅：江苏金坛市中大仪器厂。 1.3 试验方法 1.3.1 反应底物的筛选

参照章银良等[5-6]的试验条件和方法稍做改动，分别准确称取3.002 6 g 木糖和阿拉伯糖，3.603 2 g 果糖和葡萄糖，1.501 4 g 甘氨酸，2.923 8 g 赖氨酸，3.100 0 g 组氨酸，3.484 0 g 精氨酸；将以上糖与氨基酸（0.02 mol∶0.02 mol）

两两结合成16 组，分别置于小烧杯中，各加入100 mL 去离子水，然后置于磁力搅拌器上，充分搅拌使糖与氨基酸完全溶解，再用3 mol/L 的HCl 和3 mol/L 的NaOH 调节pH 值至7。最后置于油浴锅中在120 ℃下反应60 min。分别将上述制得的16 种样品对酵母菌和大肠杆菌进行抑菌圈测定，每个样品做3 次平行取平均值。对比筛选出两组分别对酵母菌、大肠杆菌抑制作用最强的MRPs 的反应底物。将筛选出的两组底物分别进行以下单因素试验。 1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 底物物质的量比对MRPs 抑菌效果的影响

参照董志俭等[3]的试验方法，体系中糖与氨基酸的物质的量比分别设置为1∶1（0.02 mol∶0.02 mol）、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5，温度为120 ℃，调节反应体系初始pH 值为11 时进行美拉德反应60 min，所得MRPs 于0 ℃保存，以备测定其抑菌性。 1.3.2.2 反应温度对MRPs 抑菌效果的影响

使体系中糖与氨基酸物质的量比为1∶1，反应温度为60、90、110、120、140 和160 ℃，调节反应体系初始pH 值为11 时，进行美拉德反应60 min，所得MRPs 于0 ℃保存，以备测定其抑菌性。 1.3.2.3 初始pH 值对MRPs 抑菌效果的影响

使体系中糖与氨基酸物质的量比为1∶1，调节反应体系初始pH 值分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11，于120 ℃下进行美拉德反应60 min，所得MRPs 于0 ℃保存，以备测定其抑菌性。

1.3.2.4 反应时间对MRPs 抑菌效果的影响

使体系中糖与氨基酸物质的量比为1∶1，调节反应体系初始pH 值为11，于120 ℃下分别进行美拉德反应30、60、90、120、150、180、210、240 和270 min，所得MRPs 于0 ℃保存，以备测定其抑菌性。

1.3.3 MRPs 抑菌圈的测定

参考谭才邓等[7-8]的方法，在无菌条件下，将经过高压蒸汽灭菌的固体培养基（酵母用YPD 培养基，大肠杆菌用LB 培养基）冷却至40～50 ℃，倒入平板。取40 μL (1.0～5.0)×104 CFU/ mL 的菌液转移至固体培养基平板表面，将涂布棒灼烧杀菌然后冷却，用其均匀涂布菌液。用经过灭菌的镊子夹取已灭菌的牛津杯摆放于培养基，用移液吸取200 μL 上述步骤制得的MRPs 加入牛津杯内，同时做空白和阳性对照。酵母菌阳性对照用乳酸，大肠杆菌阳性对照用氯霉素，均置于恒温培养箱中培养（培养温度：真菌28 ℃，细菌37 ℃）。最后，测量其抑菌圈直径，并计算3 次测量的平均值。 1.3.4 均匀试验

通过分析以上单因素试验的结果，参考章银良等[9]的试验方法，选取合适的反应时间（X1）、底物物质的量比（X2）、初始pH 值（X3）和反应温度（X4）4 个因素，以抑菌圈直径作为检测指标，选用U7（74）设计表对MRPs 的抑菌效果（果糖-赖氨酸MRPs 抑制大肠杆菌；葡萄糖-精氨酸MRPs 抑制酵母菌）进行四因素七水平的试验研究，各因素的水平设计见表1。

表1 均匀试验因素与水平Table 1 Levels and factors of uniform experiment水平 X1时间/min X2X3X4温度/ ℃1 30（1） 2∶1（3） 11（5） 150（7）2 60（2） 1∶2.5（6） 8（2） 140（6）3 90（3） 3∶1（1） 13（7） 130（5）4 120（4） 1∶1（4） 10（4） 120（4）5 150（5） 1∶3（7） 7（1） 110（3）6 180（6） 2.5∶1（2） 12（6） 100（2）7 210（7） 1∶2（5） 9（3） 90（1）物质的量比pH 值 2 结果与分析

2.1 MRPs反应底物的筛选

以SPSS 13.0 软件对不同反应底物在相同条件下制得的MRPs 对两种菌的抑菌试

验结果进行多重比较处理，结果见表2。由表2 可知，不同底物反应制得的MRPs 对两种菌的抑制效果具有差异性。反应底物为葡萄糖和精氨酸的MRPs 对酵母菌的抑菌效果最好，反应底物为果糖和赖氨酸的MRPs 对大肠杆菌的抑菌效果最佳，可能是不同微生物的细胞类型不同以及其对抑菌活性物质的敏感度差异造成的[10]。另外，甘氨酸与4 种糖制得的MRPs 对大肠杆菌与酵母菌均无抑制效果。 2.2 单因素试验结果

2.2.1 反应底物物质的量比对MRPs 抑菌效果的影响 反应底物物质的量比对MRPs 抑菌效果的影响见图1。

表2 不同MRPs 的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of different MRPs注：表中“-”表示抑菌圈直径≤8 mm，无明显抑菌作用；同一列中不同字母的表示差异显著（P＜0.05），相同字母表示差异不显著（P＞0.05）。抑菌圈直径/ mm酵母菌 大肠杆菌木糖+甘氨酸 0.00±0.00 0.00±0.00木糖+精氨酸 9.50e±0.28 10.52gh±0.22木糖+赖氨酸 0.00±0.00 14.68c±0.木糖+组氨酸 0.00±0.00 11.58def±0.37阿拉伯糖+甘氨酸 0.00±0.00 0.00±0.00阿拉伯糖+精氨酸 11.02d±0.45 11.16efg±0.15阿拉伯糖+赖氨酸 9.57e±0.23 12.04de±0.12阿拉伯糖+组氨酸 0.00±0.00 12.43d±0.27果糖+甘氨酸 0.00±0.00 0.00±0.00果糖+精氨酸 12.14c±0.11 10.08h±0.11果糖+赖氨酸 9.52e±0.15 15.84b±0.48果糖+组氨酸 0.00±0.00 11.55def±0.19葡萄糖+甘氨酸 0.00±0.00 0.00±0.00葡萄糖+精氨酸 13.86b±0.49 11.12efg±0.14葡萄糖+赖氨酸 0.00±0.00 10.51gh±0.13葡萄糖+组氨酸 0.00±0.00 10.97fgh±0.25阳性对照 16.98a±0.57 38.45a±0.31阴性对照 - -反应底物

图1 反应底物物质的量比对MRPs 抑菌性能的影响Fig.1 Effects of molar ratio of substrates on antibacterial activities of MRPs

由图1 可知，不同底物物质的量比对两种菌的抑制作用具有特异性。MRPs 对酵

母菌的抑菌圈直径随着精氨酸含量的增加明显增大；MRPs 对大肠杆菌的抑菌圈直径随果糖含量的增加而增大。葡萄糖与精氨酸的物质的量比为1∶3 时，其MRPs对酵母菌的抑制作用最强，抑菌圈直径为22. mm；果糖与赖氨酸的物质的量比为3 ∶1 时，其MRPs 对大肠杆菌的抑制效果最佳，抑菌圈直径达到18.94 mm。

2.2.2 反应温度对MRPs 抑菌效果的影响 反应温度对MRPs 抑菌效果的影响见图2。

图2 反应温度对MRPs 抑菌性能的影响Fig.2 Effects of reaction temperatures on antibacterial activities of MRPs

温度对美拉德反应影响较大，有研究表明，反应温度与美拉德反应速度呈正相关，温度相差10℃，反应速度相差3～5 倍[11]。由图2 可知，随着反应温度的升高，果糖与赖氨酸的MRPs 对大肠杆菌的抑制作用呈现逐渐上升的趋势，其抑菌活性在90 ℃ 之后迅速增长，在120 ℃时其抑菌圈直径达到最大值15.36 mm，之后略微下降然后趋于平稳。在反应温度60～100 ℃ 范围内，葡萄糖与精氨酸的MRPs 对酵母菌的抑制强度要高于果糖与赖氨酸的MRPs 对大肠杆菌的抑制强度，但在160℃时果糖与赖氨酸的MRPs 对大肠杆菌的抑菌圈直径迅速增加至13.91 mm，而在160 ℃时葡萄糖与精氨酸的MRPs 对酵母菌的抑菌圈直径迅速减小，可能是在较高温度下葡萄糖与精氨酸的MRPs中含有的醇、醛和酯类有抑菌活性的化合物[12]受热分解了。因此，葡萄糖与精氨酸的MRPs 的最佳反应温度为140 ℃，果糖与赖氨酸的MRPs 的最佳反应温度是120 ℃。 2.2.3 初始pH 值对MRPs 抑菌效果的影响 初始pH 值对MRPs 抑菌效果的影响见图3。

由图3 可知，不同初始pH 值下MRPs 对酵母菌和大肠杆菌的抑制作用具有特异性，这是由于MRPs 对两种菌的抑制机理不同。从图3 可以看出，初始pH 值为

11 时两种MRPs 分别对大肠杆菌和酵母菌的抑菌圈直径达到最大值16.85 mm 和14.74 mm，由此可知，碱性条件下制备的MRPs 具有更好的抑菌活性。可能是在碱性条件下进行美拉德反应产生了更多带有芳香环和苯酚基团的物质，它们能够与靶酶活性位点形成氢键，是其抗菌作用的主要原因[13]。 2.2.4 反应时间对MRPs 抑菌效果的影响 反应时间对MRPs 抑菌效果的影响见如图4。

图3 初始pH 值对MRPs 抑菌活性的影响Fig.3 Effects of initial pH on antibacterial activities of MRPs

图4 反应时间对MRPs 抑菌活性的影响Fig.4 Effects of reaction time on antibacterial activities of MRPs

由图4 可知，随着反应时间的延长，MRPs 的抑菌活性先小幅增加，抑菌圈直径分别由30 min时的12.36 mm 和10. mm 增加到60 min 时的最大值15. mm 和14.79 mm，而在60 min 以后略有下降之后趋于平稳；210 min 以后，MRPs 对大肠杆菌的抑菌活性呈现缓慢下降的趋势，MRPs 对酵母菌的抑菌活性快速减小。这是由于美拉德反应一般分为3 个阶段，蛋白质-多糖复合物主要是第1 阶段的Amadori 重排产物中的一类，反应时间过长将影响复合物的功能性[14]。 2.3 均匀试验结果与分析 2.3.1 均匀试验结果

按1.3.4 中均匀试验设计制备MRPs，并根据1.3.3 中操作步骤测定MRPs 的抑菌圈直径，结果见表3。

表3 均匀试验结果Table 3 Results of uniform experiment? 2.3.2 软件分析

2.3.2.1 MRPs 的酵母菌抑菌性分析

利用Mathematics 9.0 软件对表3 的MRPs 酵母菌抑菌性数据进行分析，回归分

析参数与方差结果见表4 和表5。

表4 回归参数（酵母菌）Table 4 Regression parameters（yeast）? 表5 回归方差分析结果（酵母菌）Table 5 Results of regression variance analysis(yeast）?

从表4 可知，反应初始pH 值对MRPs 抑菌活性具有显著影响（P＜0.05），加热时间与初始pH 值、加热时间与反应温度之间均具有显著（P＜0.05）的交互作用。影响MRPs 抑菌活性的主次因素顺序为：pH 值（X3）＞物质的量比（X2）＞时间（X1）＞温度（X4）。

回归方程由软件分析所得，方程为Y=10 6.4+综合分析得到最佳的制备条件为：反应时间210 min、葡萄糖与精氨酸物质的量比为1∶3、初始pH 值为12、温度120 ℃，此时MRPs 对酵母菌的抑菌圈直径理论值为23.44 mm。经验证试验，在此优化条件下得到的MRPs 对酵母菌的抑菌圈直径为22.76 mm，与理论值的相对误差为2.90%，但高于各试验组。说明均匀试验优化后的最优条件组合制备的MRPs 具有较强的抑菌活性，优化结果可靠。 2.3.2.2 MRPs 的大肠杆菌抑菌性分析

利用Mathematics 9.0 软件对表3 的MRPs 大肠杆菌抑菌性数据进行分析，回归分析参数与方差结果见表6 和表7。

表6 回归参数（大肠杆菌）Table 6 Regression parameters（E.coli）? 表7 回归方差分析（大肠杆菌）Table 7 Results of regression variance analysis（E.coli）?

从表6 可知，反应温度对MRPs 的抑菌活性具有显著影响（P＜0.05），加热时间与反应温度之间均具有显著（P＜0.05）的交互作用。影响MRPs 抑菌活性的主次因素顺序为：温度（X4）＞时间（X1）＞pH值（X3）＞物质的量比（X2）。 由软件分析所得回归方程为：Y（大肠杆菌抑菌圈直径）=115.914-1.194

37X2+2.0 07X3-0.807综合分析得到最佳的制备条件为：反应时间90 min、果糖与赖氨酸物质的量比为3∶1、反应初始pH 10、温度120 ℃，此时MRPs 对大肠杆菌的抑菌圈直径的理论值为24.24 mm。经实际验证，在此优化条件下得到的MRPs 对大肠杆菌的抑菌圈直径为23.31 mm，与理论值的相对误差为3.84%，但高于各试验组，且高于葡萄糖+精氨酸对酵母菌的抑菌效果。可能是由于赖氨酸本身具有相似于ε-聚赖氨酸的抑菌机理，Vaara[15]和Santini 等[16]研究发现，ε-聚赖氨酸在水溶液中由于带有正电荷（—NH3+），能够与革兰氏阴性菌细胞外膜结合并将其破坏，从而导致细胞死亡。同时，试验结果也说明由优化后的最优条件制备的MRPs 具有较强的抑菌活性，优化结果可靠。 3 结论

以4 种氨基酸和4 种还原糖为底物，筛选得到抑菌效果较好的两组底物：葡萄糖+精氨酸、果糖+赖氨酸；在不同反应条件下，使用两组底物分别制备MRPs，以抑菌圈直径为检测指标来表征MRPs 的抑菌活性，考察反应条件对MRPs 抑菌活性的影响。结果表明：初始pH 对MRPs 抑菌活性具有显著影响（P＜0.05），两组试验中反应温度与加热时间均具有显著交互作用（P＜0.05）。经均匀试验优化，具有高抑菌活性的MRPs 的制备条件分别为：温度120 ℃、反应时间210 min、初始pH 12 及葡萄糖与精氨酸物质的量比1∶3，合成的MRPs 对酵母菌的抑菌圈直径为22.76 mm；温度120 ℃、反应时间90 min、初始pH 10、果糖与赖氨酸物质的量比3∶1，合成的MRPs 对大肠杆菌抑菌圈直径为23.31 mm。 参考文献：

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