第２９卷第１期 ·航空航天医学杂志 ２０１８年１月 ５１ 临床论坛· 晚期糖基化终末产物（ＡＧＥｓ）对人软骨细胞自噬活性的影响研究 王朝俊 陈铖 ［摘要］ 目的张莹 张海斌梁建厦黄浩 探究晚期糖基化终末产物（ＡＧＥｓ）对人软骨细胞自噬活性的影响。方法 （１）人软骨胞采用不 同度的ＡＧＥｓ处理不同时间，采用ＣＣＫ一８法检测细胞的．活Ｉ｝生。（２）ＡＧＥｓ浓度为１００ ｍｇ／Ｌ处理人软骨细胞０ ｈ， ３ ｈ，６ ｈ，１２ ｈ，２４ ｈ，４８ ｈ后采用ＷＢ方法检测细胞ＬＣ３ Ｉ、ＬＣ３ ＩＩ的表达。（３）不同浓度的ＡＧＥｓ（５０ ｍｇ／Ｌ，１００ ｍｇ／Ｌ，２００ ｍｇ／Ｌ）处理软骨细胞２４ ｈ后，采用ＷＢ方法检测细胞ＬＣ３ Ｉ、ＬＣ３ ＩＩ的表达。结果 （１）ＣＣＫ一８结果 显示：在一定浓度范围内，ＡＧＥｓ处理人软骨胞的活性在短时间内（２４ ｈ之内）随时间的变化升高（与对照组比较 Ｐ＜０．０５）；在一定时间范围内，低浓度ＡＧＥｓ（１００ ｍｇ／Ｌ）使人软骨胞的活性升高，高浓度ＡＧＥｓ（２００ ｍｇ／Ｌ）使人软 骨胞的活性降低（与对照组比较Ｐ＜０．０５）。（２）ＡＧＥｓ浓度为１００ ｍｇ／Ｌ处理人软骨细胞ＬＣ３一Ⅱ的表达随时间 的变化明显增加，与对照组比较在２４ ｈ后更为明显（Ｐ＜０．０５）。（３）不同ＡＧＥｓ浓度处理人软骨细胞２４ ｈ后， ＬＣ３一Ⅱ的表达明显高于对照组（Ｐ＜０．０５）。结论低浓度的ＡＧＥｓ在短时间内可能通过调节软骨细胞自噬增 强细胞活性。长期的或者高浓度的ＡＧＥｓ使人软骨细胞自噬降低影响细胞的活性。 ［关键词］人软骨细胞；ＡＧＥｓ（晚期糖基化终末产物）；细胞自噬；ＬＣ３ ＩＩ ［中图分类号］ Ｒ６８４．３ ［文献标识码］ Ｂ ［文章编号］２０９５—１４３４．２０１８．０１．０２２ １．４ ＣＣＫ一８法检测细胞活性按照ＣＣＫ一８试剂盒操作 晚期糖基化终末产物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄ— ｎｃｔｓ，ＡＧＥｓ）在体内大量产生与积聚是导致和加速骨性关节 说明，制备细胞悬液，接种１００ ｕＬ到９６孔板中（含细胞 炎（ＯＡ）病变的重要原因，是致糖尿病性骨性关节炎的一 个重要分子学基础。机制可能与ＡＧＥｓ与蛋白质发生交联 的直接作用及与受体ＲＡＧＥ的结合激活细胞内一系列信 ２ｏｏｏ／￣Ｌ），３７℃培养箱中培养过夜，加入不同浓度的 ＡＧＥｓ，放入３７％培养箱中培养相应时间，加入１０ ｕＬ的ｃｃｋ 一８，孵育１—２ ｈ后酶标仪测定４５０ ｎｍ吸光度。 提取各组 号转导通路，从而引发软骨细胞自噬活性的改变有关。探 究不同浓度晚期糖基化末产物（ＡＧＥｓ）随时间的变化对人 软骨细胞自噬活性的影响。 １资料与方法 １．５ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测ＬＣ３Ｉ、ＬＣ３ＩＩ蛋白表达细胞总蛋白，ＢＣＡ法检测蛋白浓度，使各组蛋白的浓度相 同，然后ＷＢ进行ＬＣ３蛋白的检测。 １．６统计分析所有数据以均数±标准差（面４－ｓ）表示。 组间差异比较用ＡＮＯＶＡ及Ｎｅｗｍａｎ—Ｓｔｕｄｅｎｔ多重比较 检验分析，由ＳＰＳＳ１９．０统计软件完成。Ｐ＜０．０５，为差异有 统计学显著意义。 ２结果 １．１主要试剂胰蛋白酶（美国ＧＩＢＣＯ公司）；ＤＭＥＭ培 基（美国ＧＩＢＣＯ公司）；胎牛血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓ— ｔｒｉｅｓ公司）；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）（华美生物工程公司）； ＡＧＥＳ（美国ｂｉｏｖｉｓｏｎ）；ＣＣＫ一８（Ｄ￣ｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｉｅｓ）；兔源抗 ＬＣ３蛋白单克隆抗体（美国ＣＳＴ公司）。 １．２人原代软骨细胞的培养人原代软骨细胞购自ＣＨＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ（Ｃｈｉｎａ），加入ＦＢＳ１２％＋１％双抗＋ＤＭＥＭ／Ｆ —２．１ ＡＧＥｓ对人软骨细胞活性的影响 ＣＣＫ一８结果显 示：在一定浓度范围内，ＡＧＥｓ处理人软骨胞的活性在短时 间内（２４ ｈ之内）随时间的变化升高（与对照组比较Ｐ＜ ｌ２，在３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养。 １．在生长良好的１—５代软骨细胞中 ０．０５）；在一定时间范围内，低浓度ＡＧＥｓ（１００ ｍｇ／Ｌ）使人 软骨胞的活性升高，高浓度ＡＧＥｓ（２００ ｍｇ／Ｌ）使人软骨胞 的活性降低（与对照组比较Ｐ＜０．０５）。 １．３干预与分组加入１００ ｍｇ／Ｌ的ＡＧＥｓ处理０ ｈ，３ ｈ，６ ｈ，１２ ｈ，２４ ｈ，４８ ｈ 后检测相应指标。２．在生长良好的１—５代软骨细胞中加 入不同浓度ＡＧＥｓ（５０ ｍｇ／Ｌ、１００ ｍｇ／Ｌ、２００ ｍｇ／Ｌ）处理２４ ｈ 后检测相应指标，同时设立正常对照组（ｃｏｎ组）。 作者单位： 湖南师范大学第二附属医院／解放军第１６３医 院，湖南长沙４１０００３ 蒈 基金项目： 国家自然科学基金资助项目（８１２０１４３２）；湖南 Ｔｉｎｌｅ（ｈ） 省卫生计生委科研计划课题项目（Ｂ２０１６１４８）； 湖南省教育厅科学研究项目（１５Ｂ１４０）。 通讯作者 图１不同浓度ＡＧＥｓ处理不同时间对人软骨细胞活 性的影响（ 与对照组比较Ｐ＜０．０５） ５２ Ｖｏ１．２９ Ｎｏ．１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｅｒｏｓｐａｃｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｊａｎ ２０１８ ２．２不同时间ＡＧＥｓ处理对人软骨细胞自噬活性的影响 １００ ｍｇ／１ＡＧＥｓ处理人软骨细胞不同时间，ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法 循环和再利用，在维持细胞内环境自我稳态及促进细胞生 存方面发挥重要作用。自噬在抑制软骨细胞凋亡启动过 程中同样也发挥着关键的调控作用 。 。参与细胞自噬过 检测ＬＣ３一ＩＩ蛋白的表达显示ＡＧＥｓ处理的人软骨细胞的 ＬＣ３一ＩＩ／６一ａｃｔｉｎ的蛋白表达的比率随时间的变化明显增 程的信号调控分子非常复杂，目前研究最多的是ＰＩ３Ｋ／ 加，在２４ ｈ后更为明显（与对照组比较Ｐ＜０．０５）。 Ａ ＬＣ３一Ｉ ■ ＬＣ３一ＩＩ ： ： 图２ 图２ ＡＧＥｓ（１００ ｍｇ／Ｌ）处理人软骨细胞不同时间自 噬相关蛋白ＬＣ３ Ｉ、ＬＣ３ ＩＩ的表达。Ａ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测 ＡＧＥｓ（１００ ｍｇ／Ｌ）处理人软骨细胞后ＬＣ３ Ｉ、—ＬＣ３ ＩＩ的表达。 Ｂ：ＬＣ３１Ｉ蛋白表达的定量分析。数据以 ±Ｓ表示，Ｎ＝３， Ｐ＜０．０５ ＶＳ对照组。 ２．３不同浓度ＡＧＥｓ处理对人软骨细胞自噬活性的影响 ５０ ｍｇ／１ＡＧＥｓ、１００ ｍｇ／１ＡＧＥｓ、２００ ｍｒ，／１ＡＧＥｓ处理人软骨 细胞２４ ｈ后，ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测ＬＣ３Ｉｊ Ｉ蛋白表达显示１００ ｍｇ／１ＡＧＥｓ处理的人软骨细胞２４ ｈ的ＬＣ３一ＩＩ／［￣一ａｃｔｉｎ的 蛋白表达的比率明显增加（与对照组比较Ｐ＜０．０５）。 －一－ 一一：ｉ ｐ．丑ｃｔＩｎ — 簟 ｌ ｃｏｎ ５０ｍｇ／Ｌ １ＯＯｍｇ／Ｌ ２００ｍｇ／Ｌ 图３ 图３ ５０ ｍｒ／１ＡＧＥｓ、１００ ｍｇ／１ＡＧＥｓ、２００ ｍｇ／１ＡＧＥｓ处 理人软骨细胞２４ ｈ自噬相关蛋白ＬＣ３ Ｉ、ＬＣ３ １Ｉ的表达。 Ａ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测ＡＧＥｓ处理人软骨细胞后ＬＣ３ Ｉ、ＬＣ３ Ⅱ的表达。Ｂ：ＬＣ３ ＩＩ蛋白表达的定量分析。数据以 ±ｓ 表示，Ｎ＝３， Ｐ＜０．０５ ＶＳ对照组。 ３讨论 糖尿病性骨性关节炎的发病率越来越高，而该类病人 的临床症状和体征较单纯ＯＡ患者更明显 。糖尿病患者 体内由于存在糖脂代谢和胰岛素代谢紊乱，软骨、软骨下 骨、滑膜等关节组织的内环境同样存在不同程度的影响， 导致细胞代谢紊乱、炎症反应、基因表达，从而导致糖尿病 性骨性关节炎的发生 Ｊ。ＡＧＥｓ是体内蛋白质及脂类与葡 萄糖或其他还原单糖发生非酶糖化反应生成的稳定共价 化合物，糖尿病患者体内更易形成并聚积ＡＧＥｓ。ＡＧＥｓ在 体内大量产生与积聚是导致和加速ＯＡ病变的重要原因， 可能是ＯＡ患病及年龄相关因素的一个分子学基础，其机 制与关节软骨的生物力学、炎症反应、代谢改变等有 关 。 。细胞自噬（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）是一种广泛存在于真核细胞 中的特有生命现象，是机体适应不同环境的有效内部调节 机制，主要参与受损细胞器的清除、细胞内大分子物质的 Ａｋｔ／ｍＴＯＲ细胞信号通路。一方面ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号可以激 活ＮＦ—ＫＢ，导致ＲＯＳ、ＭＭＰ一１３增加并启动凋亡程序，而 ＲＯＳ可促进自噬，另一方面ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号可以激活ｍＴＯＲ 信号来抑制自噬，同时ｍＴＯＲ信号又可以反馈抑制ＰＩ３Ｋ／ Ａｋｔ信号途径的活 。另外，当自噬形成时，微管相关蛋白 １的轻链３（ＬＣ３）的细胞质型ＬＣ３（ＬＣ３ Ｉ）会水解一小段多 肽转变为自噬体膜型Ｌｃ（ＬＣ３ ＩＩ），ＬＣ３ ＩＩ水平的升高可以 估计自噬水平的升高。研究也显示，骨关节病的退变软骨 中自噬先增强后减弱，３一ＭＡ（３一甲基腺嘌呤）通过抑制 自噬加重了骨关节病的严重度，表明调控自噬可能是骨关 节病的潜在治疗靶点。有研究表明，ＡＧＥｓ诱导肾小球系 膜细胞的ＬＣ３ＩＩ／ＬＣ３Ｉ转换和Ｂｅｃｌｉｎ一１表达增加、Ｐ６２减 少，抑制自噬后ＡＧＥ诱导的细胞凋亡显著增强。自噬对晚 期糖基化终末产物诱导成骨细胞凋亡同样有保护作用。 晚期糖基化终末产物通过ＲＡＧＥ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ通路影响 成骨细胞增殖、调节成骨细胞的自噬活性。研究发现， ＡＧＥｓ诱导人正常人软骨细胞活性呈双相作用，低剂量刺 激细胞增殖、促进软骨细胞自噬，但高剂量刺激将导致细 胞自噬减弱，细胞凋亡发生；且这一作用呈明显的时效性， 随着ＡＧＥｓ的长时间的刺激软骨的自噬活性有强变弱，最 终导致软骨细胞的凋亡。因此，探明ＡＧＥｓ致骨关节炎病 变进展的机制，寻找最佳干预靶点，显得尤为重要和具有 现实意义。 参考文献 ［１］黄桢钧，刘彬，刘本荣，等．双荧光ｍＲＦＰ—ｅＧＦＰ— ＬＣ３体系在细胞自噬中的作用［Ｊ］．贵阳医学院学报， ２０１５，４０（１０）：１０２９—１０３２． ［２］马丛．不同转膜时间对免疫印迹法检测自噬蛋白ＬＣ３ 的影响［Ｃ］．２０１３年全国中医肿瘤学术年会论文集 ．２０１３：４６４—４６８． ［３］Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｍａ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｄ— ｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ—ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦ— ａｎｄ ＭＭＰ—－１３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ ＮＦ——ＫＢ ａｃｔｉ—－ ｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１４，９４（５— ６）：２６５—２７２． ［４］Ｙａｎｇ Ｑ，Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｗｕ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ——ａｃｔｉｖａ－· ｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｂｂｉｔ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＭＡＰＫ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１０，６４９ （１—３）：１０８—１１４． ［５］Ｌｊ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒａｂｂｉｔ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ 第２９卷第１期 航空航天医学杂志 ２０１８年１月 ５３ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ［Ｊ］．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２０１６， ２４（２）：３０７—３１４． 产物诱导的ＮＲＫ５２Ｅ细胞ＥＭＴ的影响［Ｊ］．第三军医 大学学报，２０１６，３８（１５）：１７３５—１７４０． ［８］付欣，徐兴欣，邵云侠，等．转化生长因子一ｐ激活激酶１ 抑制剂对ＡＧＥｓ诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞活化作用及 ［６］王海兴，李子卿，肖胤勃，等．晚期糖基化终末产物可通 过调节Ｖ—ＡＴＰａｓｅ ａ３与ＣＩＣ一７影响破骨细胞的泌酸功 能［Ｊ］．中国组织工程研究，２０１７，２１（１２）：１８２６—１８３２． 机制［Ｊ］．中国药理学通报，０１６，２３２（３）：３５５—３６０． （收稿日期：２０１７—１２—０７） ［７］莫念春，蔡稀，谢树钦，等．骨化三醇对晚期糖基终末 ＣＴ对诊断子宫内膜异位症的价值分析 邵玲 ［摘要］ 目的研究ＣＴ对诊断子宫内膜异位症的价值分析。方法收集档案室存档的３５例均进行ｃＴ检查的 子宫内膜异位症患者的病历资料进行临床分析。ｃＴ影像学扫面范围为：髂翼至耻骨联合下缘，５—１０ ｍｍ为层距 与层厚，所有患者均存在不同程度ｌ临床症状。结果参与研究的３５例病例中，卵巢异位、子宫腺肌症、腹壁切口 子宫内膜异位症 异位、膀胱内异位、外阴处异位、直肠异位患者分别为１２例、８例、８例、２例、４例及１例。结论患者的临床诊断中应结合疾病的发病机制、临床主要症状与体征及相应的辅助检查进行确诊，并做好与子宫肌 瘤、囊腺瘤、卵巢单纯性囊肿、囊腺癌等疾病的鉴别，为患者提供有效的治疗方案。 ［关键词］ ＣＴ；诊断；子宫内膜异位症；价值分析 ［中图分类号］ Ｒ８１４ ［文献标识码］ Ｂ ［文章编号］２０９５—１４３４．２０１８．０１．０２３ Ｓｙｎｅｒｇｙ ｐｌｕｓ或者美国ＧＥ８８００型螺旋ｃＴ机对患者进行扫 子宫内膜异位症是指子宫内膜间质与腺体或内膜碎 片由于手术或其他原因在子宫体腔或子宫肌层以外的部 位，如卵巢异位、子宫腺肌症、腹壁切口异位、膀胱内异位、 外阴处异位、直肠异位等，均属于子宫内膜异位症 Ｊ。子 宫内膜异位症是妇产科医生诊治较为棘手的疾病，且该病 较为常见，发病率文献报道在１０％左右 。采用ＣＴ进行 影像学辅助检查是目前诊断该病比较常用的检测方式，对 ３５例子宫内膜异位症患者进行分析，经ＣＴ检查之后患者 的诊治情况，报道如下。 １资料与方法 描干预，患者仰卧在检测设备上，从患者髂翼开始直到耻 骨联合下缘部位作为扫描范围，１０ ｍｍ为层距与层厚，利用 加５ ｍｍ薄层方式对个别部位进行增强扫描，从患者肘静 脉注射１００ ｍＬ欧乃派克之后进行扫描。 ２结果 参与研究的３５例病例中，卵巢异位、子宫腺肌症、腹壁 切口异位、膀胱内异位、外阴处异位、直肠异位患者分别为 １２例、８例、８例、２例、４例及１例。不同部位异位的患者 ＣＴ检查显示影像学变化为：子宫腺肌病：子宫均匀性、弥漫 性增大且子宫壁不断增厚，在对增厚子宫壁进行平扫的时 候发现软组织密度并不均匀，可以发现不强化的斑点状病 灶。卵巢异位（卵巢巧克力囊肿）：双侧或者单侧卵巢出现 椭圆形或者葫芦状囊实性肿块，具备比较清晰的边界，并 且经常粘连子宫体，增强扫面之后出现囊壁呈现边缘强 １．１一般资料研究的３５例样本均选自２０１５年１２月～ ２０１６年３月诊治的子宫内膜异位症患者中，所有患者均表 现出腹痛症状，且痛经现象逐年加重，伴有非周期性下腹 痛、性交痛、不育症以及月经量过多等症状。其中最大年 龄为５２岁，最小年龄为２１岁，中位年龄为（３７．８８±４．８９） 岁，最长病程１０年，最短病程１．５年，平均病程为（５．５４± ２．３６）年；参与研究的病历资料显示患者具有月经不调的 化，但是液性不强化。宫旁及盆腔内内膜异位：呈现出新 月形、椭圆形囊实性肿块，边界不清晰，可能粘连子宫后 １５例，原发不孕的６例，肛门坠胀感与性交痛者４例，尿频 尿痛的２例，周期性腹泻３例，内诊触及触痛性结节５例。 １．２方法在所有患者进行检查之前的２～３ ｈ均需要饮 水１ ０００ ｍＬ或者口服１～２％的含碘溶液，以便于对盆腔内 结肠与小肠曲进行充盈，正式进行检查之后利用５００ ｍＬ、 １％含碘溶液对肛门进行灌注，对乙状结肠与直肠进行充 壁，存在超过２５ ＵＨ的ＣＴ值。 ３讨论 子宫内膜异位症在临床研究中发病机制过程中主要 包括三大学说，第一，腔上皮化生学说，实际上是在患者的 子宫腹膜细胞以及内膜细胞均来自体腔上皮，成人部分组 织为以后进行不断分化提供依据 。第二，移植学说，实 际上是一种移植途径，如医源性播散性、淋巴、经血逆流以 盈，给予患者阴道塞常规放置干预，在充盈旁观之后对其 进行扫描，在实施平扫之后需要予以增强扫描，利用ＧＥ 及血管等；第三，诱导学说，实际上就是说脱落子宫内膜中 对某些未知物质进行释放，对未分化间质进行诱导引发子 宫内膜异位症。有研究显示引发女性发生子宫内膜异位 作者单位：沈阳市妇婴医院妇产科病房，１１００００