酿酒科技２０１７年第６期（总第２７６期）・ＬＩＱＵＯＲ—ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２０１７Ｎｏ．６（Ｔｏ１．２７６）４９ ＤＯＩ：１０．１３７４６／ｊ．ｎｊｋｊ．２０１７０２２ 起泡葡萄酒的酵母菌耐受性研究 周鹏辉，李进，李泽福，蹇木栋，袁小单 ｆ中粮长城葡萄酒（烟台）有限公司／山东省葡萄酒工程技术研究中心／山东省企业技术中心，山东蓬莱２６５６０８） 摘要： 为了研究起泡葡萄酒的酵母茵稳定性，进行山梨酸钾和游离二氧化硫不同浓度的梯度实验， 以确定不同压力条件下酵母茵的安全耐受浓度。实验结果表明，０．２０ＭＰａ的低泡葡萄酒山梨酸钾使用 浓度范围为１００～１５０ｍｇ／Ｌ、游离二氧化硫浓度为３０￣４０ｍｇ／Ｌ；０．４０ＭＰａ的高泡葡萄酒产品山梨酸钾使 用浓度范围为５Ｏ～１００ｍｇ／Ｌ、游离二氧化硫浓度为２０￣３０ｍｇ／Ｌ。 关键词：起泡葡萄酒； 酵母茵； 耐受性； 山梨酸钾； 游离二氧化硫；压力 中图分类号：ＴＳ２６２．６；ＴＳ２６１．４；ＴＳ２６１．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１—９２８６（２０１７）０６－００４９－０４ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｓｐａｒｋｌｉｎｇ Ｗｉｎｅ ＺＨｏＵ Ｐｅｎｇｈｕｉ，ＬＩ Ｊｉｎ，ＬＩ Ｚｅｆｕ，ＪＩＡＮ Ｍｕｄｏｎｇ ａｎｄ ＹＵＡＮ Ｘｉａｏｄａｎ （Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｗｉｎｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， ＣＯＦＣＯ Ｇｒｅａｔｗａｌｌ Ｗｉｎｅｒｙ（Ｙａｎｔａｉ）Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｐｅｎｇｌａｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６５６０８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｙｅａｓｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｓｐａｒｋｌｉｎｇ ｗｉｎｅ，ａ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒ— ｂａｔｅ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｓｕｌｆｕｒ ｄｉｏｘｉｄｅ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓａｆｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ．ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｂａｔｅ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｓｕｌｆｕｒ ｄｉｏｘｉｄｅ ｏｆ ０．２０ ＭＰａ ｓｅｍｉ－ｓｐａｒ－ ｋｌｉｎｇ ｗｉｎｅ ｗｅｒｅ ｌ００～１５０ ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ３０￣４０ ｍｇ／Ｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｂａｔｅ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｓｕｌｆｕｒ ｄｉ— ｏｘｉｄｅ ｏｆＯ．４０ ＭＰａ ｓｐａｒｋｌｉｎｇ ｗｉｎｅ ｗｅｒｅ ５０～１００ ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ２０￣３０ ｍｇ／Ｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｐａｒｋｌｉｎｇ ｗｉｎｅ；ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ；ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｂａｔｅ；ｆｒｅｅ ｓｕｌｆｕｒ ｄｉｏｘｉｄｅ；ｐｒｅｓｓｕｒｅ 在干型葡萄酒的发酵过程中酵母菌能彻底将 技术难题。 葡萄汁中的葡萄糖转化代谢，以保证产品在瓶储销 １材料与方法 售阶段的微生物稳定性，而对于保留了部分残糖的 半甜型、甜型葡萄酒，因其糖分的存在适于酵母菌 １．１材料 等微生物的生长繁殖，在生产中若工艺管理不善， 起泡葡萄酒基酒：烟台产区含有适量残糖的玫 极易出现浑浊或沉淀，因此微生物安全问题成为限 瑰香原酒，经下胶处理热稳定检测合格，基本指标 制残糖含量较高的葡萄酒产品发展的一个技术瓶 为：酒精度６．０％ｖｏｌ；残糖５５ Ｌ（以葡萄糖计）；总 颈。根据现有研究报道，酵母菌的活性受化学因素 酸６．０ ｅ／Ｌ（以酒石酸计）；ｐＨ３．２１：浊度０．８４ ＮＴＵ。 （如高浓度葡萄糖）、物理条件（如温度）、培养条件 酵母菌：起泡葡萄酒发酵专用酵母菌，由国内 （如营养物质）、菌龄等诸多因子的影响，而酵母菌 知名葡萄酒辅料商提供；山梨酸钾溶液：配制浓度 在压力条件下对山梨酸钾和游硫二氧化硫相关的 为１５０ ｇ／Ｌ的山梨酸钾溶液；亚硫酸稀释液：按６％ 研究较少，为此，本实验通过对酵母菌在不同压力 亚硫酸溶液：水＝ｌ：３的体积比稀释，配制１．５％的 条件的起泡葡萄酒中耐受性的研究，以探索完善该 亚硫酸溶液；双氧水溶液：将３０％的双氧水原液稀 收稿日期：２０１７—０２－２３ 作者简介：周鹏辉（１９８７一），男，河南周口人，助理工程师，大学本科，主要从事葡萄酒酿造相关的研究。 通讯作者：李泽福。 优先数字出版时间：２０１７－０５—０４；地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／５２．１０５１．ＴＳ．２０１７０５０４．０８４８．００３．ｈｔｍｌ。 ５０ 酿酒科技２０１７年第６期（总第２７６期）・ＬＩＱＵＯＲ—ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２０１７Ｎｏ．６（Ｔｏ１．２７６） 释１００倍配成０．３％的双氧水稀释液。 设备与仪器：浊度仪、恒温生化培养箱各１台； 酒样经过滤、混气、灌装等工艺处理后，两个压 力下的基本指标为：０．２０ ＭＰａ酒样：ＣＯ：４．３ ｇ／Ｌ，游 离二氧化硫Ｉ８ ｍｇ／Ｌ，酒精度６．０％ｖ０ｌ，残糖５５ ｇ／Ｌ 酵母培养基、香槟塞、铁丝扣、香槟杯、７５０ ｍＬ起泡 葡萄酒专用耐压白料玻璃瓶若干；起泡葡萄酒用混 气机和等压灌装机等配套生产设施ｌ套，意大利 进口。 １．２实验方法 （以葡萄糖计），总酸６．０ ｇ／Ｌ（以酒石酸计）：０．４０ＭＰａ 酒样：ＣＯ：７．６ ｇ／Ｌ，游离二氧化硫１８ ｍｇ／Ｌ，酒精度 ６．０％ｖｏｌ，残糖５５ ｇ／Ｌ（以葡萄糖计），总酸６．０ ｇ／Ｌ （以酒石酸计）。以不添加山梨酸钾和游离二氧化 １．２．１酵母菌纯化’ 硫的酒样作为实验空白酒样。 ２．２酵母茵接种液的浓度 为了准确了解接种液中的酵母菌浓度情况，需 要对接种液进行培养计数（平行实验），以掌握酒样 接种后酒中的实际菌浓，经测定：酵母原液的菌浓 为５．６×１０ 个／ｍＬ。 将活性干酵母活化进行单菌落分离，涂布培 养，制得纯种酵母菌。 １．２．２菌液制备 将酵母菌溶于生理盐水中制得酵母菌原液，然 后再逐级稀释制成１０～、１０之、ｌＯ一。 １．２＿３接种培养 用起泡葡萄酒混气机和等压灌装机等专业设 备分别生产０．２０ ＭＰａ和０．４０ ＭＰａ两种压力条件下 的酒样若干瓶，其中每个压力条件下在打塞前分别 添加上述浓度梯度酵母菌液ｌ ｍＬ，山梨酸钾按照 ０ ｍｇ／Ｌ、５０ ｍｇ／Ｌ、１００ ｍｇ／Ｌ、１５０ ｍｇ／Ｌ、２００ ｍｇ／Ｌ梯 ２．３ 酒样接种酵母菌的山梨酸钾作用实验 山梨酸是一种短链的不饱和脂肪酸，可以被人 体的代谢系统吸收而迅速分解为二氧化碳和水，在 体内无残留，是国家标准中允许添加的高效安全防 腐剂。生产中常用其钾盐的存在形式——山梨酸 钾，通过抑制微生物体内的脱氢酶系统，对霉菌、酵 母菌有很强的抑制作用。 实验将山梨酸钾的添加浓度分别设为０ ｍｇ／Ｌ、 ５０ ｍｇ／Ｌ、１００ ｍｇ／Ｌ、１５０ ｍｇ／Ｌ、２００ ｍｇ／Ｌ，目的在于 度适量添加（按照７５０ｍＬ／瓶计，下同），游离二氧化 硫按照０ ｍｇ／Ｌ、２０ ｍｇ／Ｌ、４０ ｍｇ／Ｌ、６０ ｍｇ／Ｌ梯度添 加，打塞后置于２５℃生化培养箱中培养，定期观察 酒体变化情况。 １．２．４酵母菌计数：将接种液（或经培养的酒样）吸 １ ｍＬ于培养基上培养，计算酵母总数。 考察Ｏ．２０ ＭＰａ和０．４０ ＭＰａ两个不同压力条件下不 同山梨酸钾浓度对酵母菌生长繁殖的抑制作用。 山梨酸钾实验的结果见表１、表２。 由表１、表２可以看出： （１）接种酵母菌液原液后，在０．２０ＭＰａ和０．４０ＭＰａ 两个不同压力条件下，酒体都出现了严重的浑浊现 １．２．５酒体观察：用手电照经培养的酒样，记录酒 体内部有浑浊或沉淀出现的时间（以天数计），同时 检测浊度，其余酒样继续培养。 ２结果与分析 ２．１ 酒样初始指标的测定 象，最终的浊度都大于７．０ ＮＴＵ，说明在此酵母菌 表１ ０．２０ ＭＰａ压力下不同山梨酸钾添加浓度的实验结果 周鹏辉，李进，李泽福，蹇木栋，袁小单・起泡葡萄酒的酵母茵耐受性研究 ５ｌ 表２ ０．４０ ＭＰａ压力下不同山梨酸钾添加浓度的实验结果 浓度下即使添加２００ ｍｇ／Ｌ的山梨酸钾仍不能达到 抑制菌体生长和繁殖的目的。但在０．２０ ＭＰａ压力 虑对游离二氧化硫的浓度进行梯度实验。 将游离二氧化硫的梯度浓度分别设定为０ ｍｇ／Ｌ、 ２０ ｍｇ／Ｌ、４０ ｍｇ／Ｌ、６０ ｍｇ／Ｌ酒样的初始游离二氧化 硫浓度为１８ ｍｇ／Ｌ，通过计算加入适量双氧水使其 浓度达到上述梯度值。具体实验结果见表３、表４。 由表３、表４可以看出： （１）接种酵母菌原液后，在０．２０ ＭＰａ和０．４０ ＭＰａ 压力条件下，酒体都出现了严重的浑浊现象，最终 的浊度都大于７．５ ＮＴＵ，说明在此酵母菌浓度下即 使６０ ｍｇ／Ｌ的游离二氧化硫仍不能达到抑制菌体生 长和繁殖的目的。但在０．２０ ＭＰａ压力下酒液开始 变化的时间和最终浑浊时间都比０．４０ ＭＰａ下的更 早，说明压力对酵母菌的生长和繁殖具有一定的抑 制作用。 下酒液开始变化的时间和最终浑浊时间都比Ｏ．４０ ＭＰａ下的更早，说明压力对酵母菌的生长和繁殖具 有一定的抑制作用。 （２）接种１０ 酵母菌液后，两个压力条件下，酒 体也都出现了较为严重的浑浊现象，说明此酵母菌 浓度下山梨酸钾仍不能起到作用，但开始变化的浊 度和最终表现浊度都较接种１００酵母菌液的稍低， 说明酵母菌的接种量直接影响浊度等酒液外观指 标。在０．２０ ＭＰａ压力下酒液开始变化的时间和最 终浑浊时间都比０．４０ ＭＰａ下出现的更早，与酵母菌 液原液表现规律一致。 （３）１０吨的酵母接种浓度，酒体已经不会出现严 重浑浊的现象，在Ｏ．２０ ＭＰａ压力下，山梨酸钾在 １５０ ｍｇ／Ｌ时酒体就未出现异常变化；０．４０ ＭＰａ压力 下，山梨酸钾在１００ ｍｇ／Ｌ时酒体未出现异常变化； 说明此酵母菌浓度时，在０．２０ ＭＰａ和０．４０ ＭＰａ压 （２）接种１０ 酵母菌液后，两个压力条件下，酒 体也都出现了较为严重的浑浊现象，说明此酵母菌 浓度下游离二氧化硫仍不能起到作用，但开始变化 的浊度和最终表现浊度都较接种酵母菌原液的延 迟和降低。在０．２０ ＭＰａ压力下酒液开始变化的时 间和最终浑浊时间仍都比０．４０ ＭＰａ下的出现的更 力条件下，山梨酸钾对酵母菌产生有效抑制作用的添 加浓度范围分别为１００￣１５０ ｍｇ／Ｌ、５０￣１００ ｍｇｍ。 （４）１０ 的酵母接种浓度，两个压力条件下，酒 体均未出现异常变化，说明在此酵母浓度下，在压 力存在时，即使０ ｍｇ／Ｌ的山梨酸钾添加量，压力也 早，与酵母菌原液表现规律一致。 （３）１０ 的酵母接种浓度，在０．２０ ＭＰａ压力下， 酒体仍出现浑浊现象，但在０．４０ ＭＰａ压力下，游离 二氧化硫在４０ ｍｇ／Ｌ时酒体未出现异常变化；说 对酵母菌的生长和繁殖产生胁迫。 ２．４酒样接种酵母茵的游离二氧化硫影响实验 在添加山梨酸钾的同时，需要考虑游离二氧化 明此酵母菌浓度时，０．２０ ＭＰａ压力和游离二氧化 硫的协同胁迫并未对酵母菌产生明显作用，而在 ０．４０ ＭＰａ压力下，协同胁迫作用明显，此压力下游 离二氧化硫产生有效抑制作用的添加浓度范围分 别为２０￣４０ ｍｇ／Ｌ。 硫与山梨酸钾对酵母菌生长抑制的协同作用，根据 上述实验初步确定０．２０ ＭＰａ和０．４０ ＭＰａ压力下山 梨酸钾浓度为１５０ ｍｇ／Ｌ、１００ ｍｇ／Ｌ，在此基础上考 ５２ 酿酒科技２０１７年第６期（总第２７６期）・ＬＩＱＵＯＲ－ＭＡＫＩＮＧＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２０１７Ｎｏ．６（３：ｏ１．２７６） 表３ ０．２０ ＭＰａ压力下不同游离二氧化硫添加浓度的实验结果 表４ Ｏ．４０ ＭＰａ压力下不同游离二氧化硫添加浓度的实验结果 （４）１０ 的酵母接种浓度，在Ｏ．２０ ＭＰａ压力下， 山梨酸钾对微生物的抑制作用更强，当游离二氧化 游离二氧化硫的添加量直至６０ ｍｇ／Ｌ时，酒体才未 出现异常变化，说明在此压力和酵母菌浓度下，游 离二氧化硫产生协同胁迫的有效作用浓度范围为 ４０￣６０ ｍｇ／Ｌ。而在０．４０ ＭＰａ压力下，酒体均未出 现异常变化，说明在此压力和酵母菌浓度下，即使 硫浓度较低时，微生物的繁殖较快，且对酒体造成 的浑浊和沉淀影响更为明显，且压力也对酵母菌产 生生存胁迫，压力越高越明显。从实验中可以得 知，建议在０．２０ ＭＰａ和０．４０ ＭＰａ两个压力条件下， 游离二氧化硫添加浓度范围分别为４０，－－－６０ ｍｇ／Ｌ、 ２０￣４０ ｍｇ／Ｌ。 ０ ｍｇ／Ｌ的游离二氧化硫添加量，压力也对酵母菌的 生长和繁殖产生胁迫。 ３结论 。 （３）从微生物安全和感官质量角度综合考虑， 建议对于Ｏ．２０ ＭＰａ左右的低泡葡萄酒产品山梨酸 钾使用浓度范围为１００Ｎ１５０ ｍｇ／Ｌ、游离二氧化硫 （１）当酵母接种量达到７５００个／ｍＬ酒样时，６～ ８ ｄ后酒体会因酵母的生长繁殖开始出现沉淀。酵 母接种量越低，酒体出现沉淀或浑浊程度就会越 小，出现的时间就会越晚；山梨酸钾的添加浓度越 大，开始出现酵母繁殖现象的时间就越晚，根据实 浓度为３０￣４０ ｍｇ／Ｌ浓度过高会对感官产生刺激， 影响消费者体验；０．４０ ＭＰａ左右的高泡葡萄酒产品 山梨酸钾使用浓度范围为５０～１００ ｍｇ／Ｌ、游离二氧 化硫浓度为２０，￣３０ ｍｇ／Ｌ。但无论何种类型的产 品，灌装前均应通过除菌过滤，确保装瓶的酒液中 无任何酵母菌的存在。 参考文献： ［１】杨亚珍，查凡，果然，等．酿酒酵母的紫外诱变选育及发 酵条件研究［Ｊ】．湖北农业科学，２０１５（７）．１６６４—１６６７． 验结果，建议在Ｏ．２０ ＭＰａ和０．４０ ＭＰａ两个压力条件 下，山梨酸钾添加浓度范围分别为ｌ００～１５０ ｍｇ／Ｌ、 ５０～１００ ｍｇ／Ｌ。 （２）对酵母的生长抑制作用来讲，游离二氧化 硫和山梨酸钾之间存在协同抑制作用，总体来看， （下转第５６页） ５６ 酿酒科技２０１７年第６期（总第２７６期）・ＬＩＱＵＯＲ－ＭＡＫＩＮＧＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２０１７Ｎｏ．６（Ｔｏ１．２７６） 表ｌ 不同地域糯高粱与粳高粱籽粒理化指标 绵甜，入口后味较好。糯高粱作为清香型大曲白酒 国农业科学，２０１３（６）：１１２７—１１３５． ［３】卢庆善．高粱学［Ｍ】．北京：中国农业出版社，１９９９：１５６ ［４】徐占成，徐姿静．酒体风味设计学概论［Ｊ］．酿酒，２０１２ （６）：３－８． 的酿造原料有很好的推广和研究价值。 参考文献： ［１】李永寿．高粱是酿制白酒的最佳原料［Ｊ］．酿酒，１９９９（６）： １—４． 【５］ 闰鸿雁，胡国宏，栾天浩，等．关于北方酒用高粱育种目 标的探讨与实施策略［Ｊ］．农业网络信息，２００５（１２）： 】２２－】２４ ［２】赵国君，徐智斌，冯波，等．糯小麦的酿酒特性研究［Ｊ］．中 （上接第５２页） ［２ 李进，２］李泽福，都振江．低醇半干白葡萄酒的酵母菌耐受 性研究［Ｊ］．中国酿造，２０１１（１０）：１１９—１２１． ２００１（６）：２８—２９． ［６］ 福杰桑．葡萄酒酿造微生物学——实验技术与规程 ［Ｍ】．徐岩，康文怀，译．北京：中国轻工业出版社，２０１０． ［７】翁秀花．山梨酸钾如何防止葡萄酒二次发酵【Ｊ］．饮料， １９９９，６（５）：４４～４５． 【３】高年发，高玉荣．１氐醇干白葡萄酒生产工艺的研究［Ｊ］．酿 酒科技，２０００（６）：７６—７８． ［４】黄宏慧．低度甜型葡萄酒微生物超标的原因及对策［Ｊ］． 食品与生物，２００７（７）：９． ［８】尹卓容，王飚．葡萄酒生产中合理使用ＳＯ ［Ｊ］．中外葡萄 与葡萄酒，２０００（２）：５４—５７． 【５】樊玺，李记明．酵母菌的生长因子及特性［Ｊ］．酿酒科技，
