人羊膜上皮细胞培养工艺的优化及生物学特性

刘超;徐志国;王绍红;程红玲;杨旭巍;贡波;刘洋;徐春艳

【摘 要】背景:目前人羊膜上皮细胞分离、培养及冻存的研究较为分散,难以形成全面有效的方案以满足未来对移植用干细胞的临床需求.目的:建立人羊膜上皮细胞优化的分离、培养与冻存工艺,并对其生物学特性进行研究.方法:运用正交法研究各因素对人羊膜上皮细胞分离、培养及冻存指标的影响,极差法分析数据得到优化的分离、培养与冻存工艺条件.对人羊膜上皮细胞进行原代与传代培养,通过镜下形态学观察,绘制细胞生长曲线,进行流式细胞术检测、免疫荧光染色及向肝样细胞分化等实验,观察人羊膜上皮细胞的生物学特性.结果与结论:①获得优化的人羊膜上皮细胞分离条件为:胰酶浓度0.25%,分4次消化,每次消化时间20 min;优化培养条件为:细胞接种浓度为4×108 L-1,表皮生长因子质量浓度为10μg/L,血清体积分数为5%;优化冻存条件为:细胞冻存浓度为1×1010 L-1,二甲基亚砜浓度为10%,血清体积分数为80%;②原代细胞在接种二三天内贴壁生长,贴壁后细胞呈不规则多角形,以铺路石样生长,传代后细胞贴壁与生长速度加快,冻存复苏的传代第2代细胞生长与扩增能力无明显下降;③免疫荧光染色显示,原代人羊膜上皮细胞强表达CK19、SSEA-4,不表达Vimentin、CD45和HLA-DR;原代与传代第4代免疫表型检测显示,人羊膜上皮细胞在培养传代过程中有上皮间充质转化现象发生;④向肝样细胞分化实验中,免疫荧光染色显示,诱导后的人羊膜上皮细胞肝细胞标志物白蛋白、CK18表达量明显上升,糖原染色显示诱导3周后的人羊膜上皮细胞有糖原合成;⑤结果表明,人羊膜上皮细胞易于获得且体外增殖能力强,表达胚胎干细胞保持未分化状态的表面标志物.%BACKGROUND:As current studies on isolation, culture and cryopreservation of human amniotic epithelial cells (hAECs) are relatively scattered, it is difficult to form a comprehensive and effective solution to

meet the clinical needs of stem cells for transplantation in

future.OBJECTIVE:To establish the technology of isolation, culture and cryopreservation of hAECs, and to study the biological characteristics of hAECs.METHODS:Orthogonal method was used to study the effects of different factors on the separation, culture and cryopreservation, and range method was adopted to analyze the data to optimize the separation, culture and cryopreservation. We performed cell primary and passage cultures, morphology observed by microscope, drawn cell growth curve and flow cytometry assay, immunofluorescence staining, hepatocyte like cell differentiation to study the biological characteristics of hAECs.RESULTS AND CONCLUSION:(1) The optimal hAECs separation conditions were as follows:trypsin digestions were conducted at a concentration of 0.25%, four times, once for 20 minutes digestion; optimal conditions of culture were 4×108/L cell seeding density, 10 μg/L epidermal growth factor, 5% serum; optimal conditions of cryopreservation were 1×1010/L cell cryopreservation density, 10% dimethyl sulfoxide, 80% serum. (2) The primary cells were adhered to the wall in 2-3 days, exhibiting irregular polygon, paving stone-like growth. Cell adherence and growth rate were accelerated after subculture, and the growth and proliferation ability of passage 2 cells were not significantly decreased after cryopreservation and resuscitation. (3) Immunofluorescence staining showed that the primary cells strongly expressed SSEA-4 and CK19, but did not express Vimentin, CD45 and HLA-DR. The immunophenotype statistics of the primary and passage 4 cells showed the epithelial mesenchymal transition of hAECs in

culture process. (4) Immunofluorescence staining showed that the liver cell marker expression of ALB, CK18 was significantly increased after hAECs were induced to differentiate into hepatocyte-like cells. Glycogen staining revealed glycogen synthesis in hAECs after 3 weeks of induction. To conclude, hAECs are easy to obtain and have strong proliferation ability in vitro, and express surface markers for undifferentiated embryonic stem cells.

【期刊名称】《中国组织工程研究》 【年(卷),期】2017(021)013 【总页数】8页(P2100-2107)

【关键词】干细胞;培养;人羊膜上皮细胞;正交法;生物学特性;冻存工艺 【作 者】刘超;徐志国;王绍红;程红玲;杨旭巍;贡波;刘洋;徐春艳

【作者单位】浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000;浙江省脐带血造血干细胞库,协和华东干细胞基因工程有限公司,浙江省湖州市 313000

【正文语种】中 文 【中图分类】R394.2

0 引言 Introduction

干细胞移植凭借其细胞来源丰富、不易感染、免疫原性低和并发症少等优点，已逐渐成为当今生物医学研究的热点。人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)是位于人胎盘羊膜上立方体柱状紧密排列的单层细胞，表达多种胚胎干细胞表面标记，是一类具有自我更新与多向分化潜能的成体干细胞[1-2]。 目前国内外常用的hAECs分离方法是胰酶分步消化法[3]。Sean等[4]使用谷类中表达的牛胰蛋白酶重组体，37 ℃水浴下两步胰酶消化方法，得到上皮细胞(12±4)×107。Gita等[5]在培养hAECs时发现在相同时间内，DMEM/F12培养基比Epilife培养基(相对于其他无血清培养基更能延长表皮角质细胞在体外的寿命)在总的细胞扩增数量上更具有优势。研究认为，在hAECs培养过程中，添加不同体积分数的血清与生长因子或以不同细胞浓度接种培养，对hAECs的增殖及分化均有影响[6-8]。研究人员发现，影响hAECs冻存效果的因素有细胞冻存浓度、冻存细胞保护剂(如二甲基亚砜)浓度、添加的血清体积分数等[9-11]。陈露萍等[12-13]的研究结果表明，选择合适的二甲基亚砜浓度，能提细胞复苏效率，并保持其良好的生物学特性。

现有的研究对hAECs分离、培养与冻存条件摸索较为分散，缺乏统一有效的方案来获得满足临床需要。鉴于此，实验使用正交实验方法全面地对hAECs分离、培养及冻存方案进行优化，以求获得足够数量且具备多向分化潜能的hAECs，通过对其生物学特性进行研究，为今后hAECs的临床应用奠定基础。 1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞学体外观察实验

1.2 时间及地点 实验于2014年1月至2015年10月在浙江省干细胞工程研究中心实验室完成。

1.3 材料 健康、足月剖宫产新生儿的羊膜共20例，取自于湖州妇保院健康产妇(乙肝、丙肝、人类免疫缺陷病毒及梅毒等血清学反应显示为阴性)，经产妇授权同意。

主要试剂与仪器：胰蛋白酶、D-MEM/F12培养基、胎牛血清(美国GIBCO公司)；二甲基亚砜(美国ORIGENE公司)；小鼠抗人CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD45、SSEA-4、CK19、Vimentin、HLA-DR、AFP、白蛋白、CK18单克隆抗体，小鼠IgG1k对照抗体，流式细胞仪(美国BD公司)；肝细胞生长因子、成纤维生长因子、胰岛素样生长因子(美国Peprotech公司)；SABC免疫组织化学染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；糖原PAS染色试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；荧光显微镜(日本Nikon公司)；CO2培养箱、液氮储存罐(美国Thermo公司)；低速离心机(美国Beckman公司)。 1.4 实验方法

1.4.1 hAECs的分离 无菌条件下机械法剥离羊膜组织，含有双抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)的PBS洗去表面凝血块等杂质。将羊膜组织按质量均分为5 g的小块，采用胰酶分步消化方法分离hAECs。每次胰酶消化完后，使用玻璃棒搅拌羊膜组织2 min，过200目滤网收集hAECs，滴加胎牛血清终止胰酶消化。合并过滤液500×g离心5 min，离心2次，收集细胞。细胞接种培养前取小样进行锥虫蓝染色，细胞计数板计数活细胞量。流式细胞仪测得细胞的SSEA-4阳性率。SSEA-4阳性细胞数由下式获得：SSEA-4阳性细胞量=活细胞量×SSEA-4阳性率。 以相同质量羊膜获得SSEA-4阳性细胞量为考察分离效果的指标，选取胰酶浓度、消化时间与消化次数3个影响分离指标的因素，每个因素设定3个水平，进行正

交实验。实验分9组，每组水平组合设3次重复。极差法分析正交实验数据，排序各因素对分离指标影响效果的大小，并获得优化的hAECs分离方案。

1.4.2 人羊膜上皮细胞培养与传代 选用低糖型D-MEM/F12培养基，添加一定体积分数的胎牛血清与表皮生长因子，以选定的细胞浓度接种hAECs于T25细胞培养瓶中，每瓶接种5 mL培养基，置于体积分数5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。培养基每3 d换液1次，7 d后胰酶消化，收集hAECs。取小样进行锥虫蓝染色，细胞计数板计数活细胞量。流式细胞仪测得细胞的SSEA-4阳性率。每天倒置显微镜下观察hAECs细胞形态与增殖情况，待细胞汇合度达到90%以上时，胰酶消化贴壁细胞，重新按细胞接种密度与培养基配置进行传代培养。

以培养7 d的SSEA-4阳性细胞量/细胞接种量作为考察培养效果的指标，选取细胞接种浓度、血清体积分数与细胞生长因子质量浓度3个影响培养指标的因素，设计培养因素的3个水平进行正交实验，每组水平组合设3次重复。同样采用极差法分析数据，得到各因素对培养指标影响效果的大小，并获得优化hAECs培养方案。

1.4.3 hAECs的冻存与复苏 hAECs冻存保护液由胎牛血清、二甲基亚砜液和D-MEM/F12培养基3种试剂组合而成。细胞冻存前，用胰酶消化离心获取hAECs，以选定的细胞冻存浓度与细胞冻存液混合均匀，分装于细胞冻存管中，每管1.5 mL。hAECs冷冻程序为：4 ℃10 min→-20 ℃30 min→-80 ℃ 24 h→-196 ℃液氮长期保存。

从液氮罐中取出冻存的hAECs细胞冻存管，立即放入事先准备的37 ℃温水中，使其迅速解冻。在无菌条件下，加入适量的D-Hank’s液混合均匀，300×g离心5 min，收集hAECs，取小样进行锥虫蓝染色，细胞计数板计数活细胞量(细胞

冻存前同样计数活细胞量)。以下式计算hAECs复苏细胞存活率：复苏细胞存活率=复苏后hAECs活细胞量/冻存前hAECs活细胞量。

以冻存30 d的复苏细胞存活率作为考察冻存效果的指标，选取细胞冻存浓度、血清体积分数与二甲基亚砜浓度3个影响冻存指标的因素，按正交法设计冻存因素水平表，每组水平组合3次重复。依然采用极差法分析数据，得到各因素对冻存指标影响效果的大小，并获得优化的hAECs冻存方案。

1.4.4 苏木精-伊红染色 取传代第1代贴壁hAECs，PBS洗涤3次，体积分数95%乙醇固定。PBS室温洗涤3次，苏木精染色10 min后，用蒸馏水冲洗。体积分数70%盐酸乙醇分化数秒，氨水返蓝30-60 s，蒸馏水冲洗。1%伊红染液染色5 min，体积分数95%乙醇作用5 min，在倒置显微镜下观察染色后的细胞。 1.4.5 hAECs生长曲线 取传代第1代hAECs单细胞悬液，接种于T25细胞培养瓶，接种细胞浓度为4×108 L-1，每瓶接种5 mL，共接种24瓶细胞，置于体积分数5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。每隔24 h取3瓶细胞，弃去培养基中未贴壁hAECs，胰酶消化计数贴壁细胞数，计算均值，连续计数8 d。依据计数结果，时间(天)为横坐标，贴壁细胞数(105)为纵坐标，绘制hAECs生长曲线。

1.4.6 流式细胞术分析 收集原代与传代第4代hAECs，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×109 L-1，取200 μL细胞悬液，加入10 μL 荧光标记目标单抗，混匀，室温避光孵育30 min。加入1 mL PBS洗涤，300×g离心5 min。弃上清，用300 μL PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测细胞表面标记物的表达，小鼠IgG1k-PE作同型对照。每份样品检测20 000个细胞，数据结果用CellQuest软件进行分析。

1.4.7 免疫荧光染色 将染色原代hAECs用PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗涤3次。滴加PBS稀释的体积分数10%山羊血清室温封闭

20 min，PBS洗涤3次。滴加PBS稀释的1%一抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次。滴加PBS稀释的1%生物素化二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次。滴加PBS稀释的1% SABC-FITC (或SABC-CY3)，37 ℃孵育30min，PBS洗涤4次。荧光显微镜下观察，阴性对照组用PBS代替一抗。

1.4.8 体外肝细胞样细胞诱导体系的建立 取传代第1代hAECs，接种于12孔板内，细胞浓度为4×108 L-1，培养基选用DMEM/F12(含体积分数5%胎牛血清)。设置阴性对照组(未加诱导剂)3孔，余下9孔为诱导组(加诱导剂)。培养1 d后细胞基本贴壁，除去未贴壁细胞，在阴性对照组加入原培养基，在诱导组中用如下诱导体系：DMEM/F12(含体积分数5%胎牛血清)+肝细胞生长因子(20 μg/L)+成纤维生长因子(10 μg/L)+胰岛素样生长因子(10 μg/L)+Dex(500 nmol/L)。 培养基每3 d更换1次，诱导周期为3周。分别取第1，3周的细胞做白蛋白和CK18的免疫荧光染色，取未诱导和诱导3周的细胞做PAS染色(糖原染色)检测。 糖原PAS染色：在孔板内对贴壁细胞直接染色，PBS洗涤3 min×2次；体积分数95%乙醇固定10 min；1%过碘酸水溶液5-10 min，蒸馏水洗多次，晾干；Schiff液10-15 min，细胞变淡红色；微温自来水(流水)漂洗5 min；苏木精复染细胞核1-3 min；自来水漂洗5min；脱水；透明；封固。

1.5 主要观察指标 ①正交法优化hAECs分离、培养及冻存因素条件；②hAECs 形态学观察；③传代第1代hAECs增殖能力；④hAECs 表面分子标志物的表达；⑤诱导后hAECs肝细胞标志物的表达与糖原染色鉴定。

1.6 统计学分析 数据以±s表示。采用GraphPad Prism 5软件对数据进行方差分析及t 检验，当P < 0.05时认定样本间差异有显著性意义。 2 结果 Results

2.1 hAECs的分离 极差法分析分离因素正交实验结果，由表1数据得到分离指标——“SSEA-4阳性细胞量”极差最大的因素是消化次数，即消化次数对SSEA-4

阳性细胞量影响最大。各因素影响大小排序：消化次数(C)>消化时间(B)>胰酶浓度(A)。比较各因素不同水平的 值，获得优化的分离因素组合为A2B2C3，即胰酶浓度0.25%，消化时间20 min，分4次消化。

2.2 hAECs的培养 极差法分析培养因素正交实验结果，由表2得到培养指标——“SSEA-4阳性细胞量/细胞接种量”极差最大的因素是细胞接种浓度，即细胞接种浓度对SSEA-4阳性细胞量/细胞接种量影响最大。各因素影响大小排序：细胞接种浓度(A)>血清体积分数(C)>表皮生长因子质量浓度(B)。比较各因素不同水平的 值发现，表皮生长因子质量浓度的最高 值()与第二值()数值接近，但表皮生长因子质量浓度水平2仅为水平3的一半，从方案经济性考虑，表皮生长因子质量浓度应选择水平2(10 μg/L)更为适宜，故优化的培养因素组合为A3B2C2，即细胞接种浓度4×108 L-1，血清体积分数为5%，表皮生长因子质量浓度10 μg/L。 2.3 hAECs的冻存 极差法分析冻存因素正交实验结果，由表3得到，细胞冻存浓度与血清体积分数的极差相近，表明两者对冻存指标——“复苏细胞存活率”的影响程度相近。二甲基亚砜浓度的极差最大，表明二甲基亚砜浓度对复苏细胞存活率影响最大。各因素影响大小排序：二甲基亚砜浓度(C)>细胞冻存密度(A)>血清体积分数(B)。通过各因素不同水平的值比较，得到优化的冻存因素组合为A2B3C2，即细胞冻存浓度1×1010 L-1，血清体积分数为80%，二甲基亚砜浓度10%。

2.4 hAECs形态学观察与生长曲线 体外原代培养的hAECs在光镜下呈典型上皮细胞形态。细胞接种后二三天内贴壁生长，刚贴壁的细胞呈圆形，折光性较强。完全贴壁后细胞胞质展开，呈不规则多角形，折光性减弱。原代hAECs 7 d左右形成单层贴壁细胞，呈铺路石样生长。传代后第2代细胞增殖速度加快，5 d左右可形成单层贴壁细胞。hAECs培养4代后细胞胞体略有变大，细胞增殖速度减缓(图1A)。苏木精-伊红染色后观察，传代第1代细胞大小较均一，细胞核染蓝色，核

膜清晰，核仁明显，胞浆染红色，胞质丰富(图1B)。

传代第1代hAECs接种于培养瓶后，0-2 d为细胞生长潜伏期，以细胞贴壁过程为主。3-5 d生长曲线曲率最大，为hAECs快速增殖的指数生长期；6 d后生长速度减缓，细胞基本长满培养瓶底，进入平顶期。传代第1代培养细胞符合典型的细胞生长曲线(图1C)。

2.5 免疫荧光染色检测结果 免疫荧光染色显示，原代hAECs表达上皮细胞表面标志CK19和胚胎干细胞表面标志SSEA-4，不表达间充质细胞标志波形蛋白Vimentin和移植排斥发生密切相关的HLA-DR(图2)。表明hAECs免疫原性低，用于细胞治疗不易发生移植排斥现象。

2.6 hAECs流式细胞术检测结果 流式细胞仪检测原代hAECs强阳性表达SSEA-4，阳性表达间充质干细胞相关标志物CD73，弱阳性表达CD90，CD105和SSEA-1阳性表达量很低，造血细胞表面标志物CD34、CD45几乎不表达，同样不表达HLA-DR(图3)。

实验通过对原代与传代第4代hAECs(DMEM/F12+体积分数5%胎牛血清)相关免疫表型流式检测发现，传代第4代hAECs的SSEA-4和CK19表达较原代显著减少(P < 0.000 1)，Vimentin和CD105表达P4较原代细胞显著增多(P < 0.000 1)，原代与传代第4代hAECs均不表达HLA-DR (图4)。

SSEA-4是细胞全能性表达标志物，CK19是上皮细胞特异性表达标志物，Vimentin和CD105是间充质细胞的特异性表达标志物。实验结果表明，hAECs经过培养传代后，细胞在“分化全能性”上有所减弱。上皮细胞与间充质细胞标志物的变化表明，hAECs培养过程符合上皮间充质转化的特征表现。然而，培养过程中与免疫排斥密切相关的HLA-DR始终不表达，表明hAECs能始终保持免疫原性低的特性，有利于降低细胞治疗过程中排斥反应的发生概率。

2.7 hAECs诱导后的免疫荧光染色与糖原染色 成熟肝细胞高表达白蛋白与CK18。

诱导后细胞免疫荧光染色显示，诱导3周后hAECs的白蛋白与CK18表达量均较诱导1周明显增加(图5)。

表1 人羊膜上皮细胞分离因素正交实验结果Table 1 Orthogonal experiment results of isolation factors of human amniotic epithelial cells表注：各分离因素在同一水平下分离指标的平均数，如=(8.21+18.68+16.13)/ 3=14.34。各分离因素在不同水平条件下分离指标平均数的极差，如因素A的极差为R=-=17.47-14.34=3.13。实验 因素 SSEA-4阳性细胞量(×106)胰酶浓度A 消化时间B 消化次数C 1 1(0.125%) 1(15 min) 1(2次) 8.21±0.18 2 2(0.25%) 1(15 min) 2(3次) 13.24±1.01 3 3(0.375%) 1(15 min) 3(4次) 19.26±1.30 4 1(0.125%) 2(20 min) 2(3次) 18.68±0.71 5 2(0.25%) 2(20 min) 3(4次) 21.04±0.56 6 3(0.375%) 2(20 min) 1(2次) 14.30±0.55 7 1(0.125%) 3(25 min) 3(4次) 16.13±0.80 8 2(0.25%) 3(25 min) 1(2次) 18.15±1.22 9 3(0.375%) 3(25 min) 2(3次) 13.20±1.18 SSEA-4阳性细胞量(×106) T _ _ 1 T _ 2 T 3 R 14.34±0.29 13.57±0.57 13.56±0.41 17.47±0.46 18.01±0.28 15.04±0.51 15.59±0.32 15.83±0.17 18.81±0. 3.13 4.44 5.25

表2 人羊膜上皮细胞培养因素正交实验结果Table 2 Orthogonal experiment results of culture factors of human amniotic epithelial cells实验 因素 SSEA-4阳性细胞量细胞接种量(%)细胞接种浓度A 血清体积分数B 表皮生长因子质量浓度C 1 1(1×108 L-1) 1(2%) 1(0 μg/L) 30.49±1.09 2 1(1×108 L-1) 2(5%) 2(10 μg/L) 36.18±4.47 3 1(1×108 L-1) 3(10%) 3(20 μg/L) 31.69±0.47 4 2(2×108 L-1) 2(5%) 1(0 μg/L) 94.99±4.90 5 2(2×108 L-1) 3(10%) 2(10 μg/L) 85.63±5.77 6 2(2×108 L-1) 1(2%) 3(20 μg/L) 70.84±0.33 7 3(4×108 L-1) 3(10%) 1(0 μg/L) 113.52±5.44 8 3(4×108 L-1) 1(2%) 2(10 μg/L) 127.96±7.85 9 3(4×108 L-1) 2(5%) 3(20 μg/L) 147.67±3.29 SSEA-4阳性细胞量/细胞接种量

(%) T _ _1 T_2 T3R 32.79±1.78 76.43±2.66 79.67±1.52 83.82±3.50 92.95±3.27 83.26±5.04 129.72±2.46 76.95±0.96 83.40±1.35 96.93 16.52 3.73

表3 人羊膜上皮细胞冻存因素正交实验结果Table 3 Orthogonal experiment results of cryopreservation factors of human amniotic epithelial cells实验 因素复苏细胞存活率(%)细胞冻存浓度A 血清体积分数B 二甲基亚砜浓度C 1 1(0.5×1010 L-1) 1(10%) 1(5%) 92.37±1.59 2 1(0.5×1010 L-1) 2(40%) 2(10%) 96.43±0.98 3 1(0.5×1010 L-1) 3(80%) 3(20%) 91.85±0.28 4 2(1×1010 L-1) 2(40%) 1(5%) 95.29±0.22 5 2(1×1010 L-1) 3(80%) 2(10%) 96.06±0.18 6 2(1×1010 L-1) 1(10%) 3(20%) 92.18±0.74 7 3(2×1010 L-1) 3(80%) 1(5%) 95.27±1.14 8 3(2×1010 L-1) 1(10%) 2(10%) 95.74±0.41 9 3(2×1010 L-1) 2(40%) 3(20%) .45±1.02复苏细胞存活率(%) T _ _1 T_2 T3R 93.55±0.88 93.43±0.25 94.31±0.81 94.51±0.26 93.72±0.38 96.08±0.38 93.48±0.42 94.39±0.52 91.16±0.51 1.03 0.96 4.92

hAECs诱导3周后经糖原PAS染色显示，紫红色物质为反应阳性物质——糖原，蓝色物质为细胞核(图6)。显示hAECs经实验诱导方案诱导后，成功获得具有一定合成功能的肝样细胞。 3 讨论 Discussion

hAECs应用于临床的前提条件是保证能够获得足够数量且具备多向分化能力的细胞。在选取分离及培养指标时，选取了hAECs的SSEA-4细胞表面标志物表达作为考察的重点。SSEAs即阶段特异性胚胎抗原，常表达于胚胎发育的早期，人胚胎干细胞表达SSEA-3和SSEA-4，不表达SSEA-1。刚分离的hAECs其高表达SSEA-4，从某种程度上说明其分化原始性较高，再者hAECs目前尚无其特异性表面标记，因其表现出的区别于其他干细胞而更类似于胚胎干细胞的特性，所以实验

选取了SSEA-4作为其未分化的鉴定标志物。在探讨hAECs分离、培养及冻存优化条件时，分别选择了3因素3水平对分离、培养及冻存指标进行研究。如果进行全面实验，工作量大且实验误差不易控制。因此研究采用正交实验方法进行研究，大幅度减少实验次数，达到了较好预期目的。并且，在获得优化实验条件的同时，得到了各因素对分离、培养及冻存指标的影响大小排序。因此，研究所获取hAECs的分离培养及冻存方案对于其临床应用具有很好的适用性。

hAECs常用的分离方法有组织块法与酶消化法两种[14-16]。在预实验中对组织块法的适用性进行了实验，发现只有极少量的hAECs从组织块中向培养瓶底部贴壁。由于细胞生长密度过低，后续培养中也无法有效扩增。猜测hAECs自身迁移能力远不如人羊膜间充质细胞，因此组织块法不适用于hAECs分离。由于胰蛋白酶对细胞的损伤作用，使得长时间胰酶消化所得的细胞不易贴壁且成活率低，但消化时间缩短又不能得到足够量的细胞[17]。综合上述情况，采用胰酶分步消化方法，配合正交实验，对影响分离效果的因素条件进行优化。实验中发现，消化25 min获得的SSEA-4阳性细胞量反而比消化20 min低。从而推断，长时间胰酶消化造成的细胞损伤可能影响到细胞标志物的表达。同时，实验结果说明了适中的胰酶浓度(0.25%)可获得最高的SSEA-4阳性细胞量。在实验中，随着消化次数的增多，获得的SSEA-4阳性细胞量也逐渐增多，结合优化的消化时间和胰酶浓度，4次消化获得细胞量接近成熟羊膜3×108左右的上皮细胞总量。由此可见，胰酶分步消化法能够在保证细胞不被酶损伤的前提下，较大程度获得未分化的hAECs。 图1 人羊膜上皮细胞形态学观察与生长曲线Figure 1 Morphological

observation and growth curve of human amniotic epithelial cells图注：图中A为原代与传代人羊膜上皮细胞光镜下不同培养时间的细胞形态学观察(×40，比例尺=300 μm)，原代培养7 d左右形成单层贴壁细胞，呈铺路石样生长；传代后第2代细胞增殖速度加快，5 d左右可形成单层贴壁细胞；传代培养4代后细胞

胞体略有变大，细胞增殖速度减缓；B为传代第1代人羊膜上皮细胞苏木精-伊红染色(×100，比例尺= 100 μm)，细胞大小较均一，细胞核染蓝色，核膜清晰，核仁明显，胞浆染红色，胞质丰富；C为传代第1代人羊膜上皮细胞生长曲线。 图2 原代人羊膜上皮细胞免疫荧光染色(×100，比例尺=100 μm)Figure 2 Immunofluorescence staining of primary human amniotic epithelial cells (×100, scale bar=100 μm)图注：图中A-D分别为CK19、SSEA-4、Vimentin及HLA-DR免疫荧光染色，显示原代人羊膜上皮细胞表达上皮细胞表面标志CK19和胚胎干细胞表面标志SSEA-4，不表达间充质细胞标志波形蛋白Vimentin和移植排斥发生密切相关的HLA-DR。

图3 原代人羊膜上皮细胞流式细胞术检测Figure 3 Flow cytometry assay of primary human amniotic epithelial cells

图4 原代与传代第4代人羊膜上皮细胞免疫表型统计Figure 4 Immune phenotypes of primary and passage 4 human amniotic epithelial cells 图5 人羊膜上皮细胞向肝样细胞诱导的免疫荧光染色(×100，比例尺=100 μm)Figure 5 Immunofluorescent staining of human amniotic epithelial cells after hepatocyte-like induction (×100, scale bar=100 μm)图注：诱导3周后细胞的白蛋白与CK18表达量均较诱导1周时明显增加。

图6 人羊膜上皮细胞向肝样细胞诱导3周后的糖原PAS染色(×200，比例尺=100 μm)Figure 6 Glycogen staining of human amniotic epithelial cells 3 weeks after hepatocyte-like induction (×200, scale bar=100 μm)图注：图中A为人羊膜上皮细胞向肝样细胞诱导3周后，紫红色物质为反应阳性物质——糖原，蓝色物质为细胞核；B为未经诱导的人羊膜上皮细胞，无紫红色阳性物质。 作为对培养指标影响最为关键的细胞接种浓度，4× 108 L-1相比于一般干细胞培养的接种浓度来说已很高。实验中发现，较低接种浓度下(1×108 L-1)，无论选择

何种水平的表皮生长因子与血清体积分数，培养7 d后仍然有大部分细胞未贴壁。而在较高接种浓度下(4×108 L-1)，几乎所有的hAECs在72 h内完成贴壁。这种现象的发生可能是因为低浓度培养导致细胞间相互交联程度低，增值信号弱，hAECs出现了复制性衰老[18-19]。当提高接种浓度，上述情况很快消失，因此较高的细胞接种浓度有利于刺激hAECs增殖。血清能提供维持细胞指数生长的激素及基础培养基中没有或量很少的营养物，血清体积分数过低，hAECs增殖慢，过高则会产生更多的代谢产物，反而可能抑制生长，甚至促进hAECs分化[20-21]，这与实验中5%的最佳血清体积分数相符。研究发现，hAECs 表达大量整联蛋白类，整联蛋白依赖型表皮生长因子受体)的活化是参与细胞增殖信号的机制之一[22-23]。因此通过添加适量的表皮生长因子，对于hAECs培养过程中促进细胞增殖具有积极的作用。实验发现，无论是从细胞形态学或是细胞表面标志物流式检测上来看，hAECs在传代过程中都发生了上皮间充质转化的现象。Gita等[5]也通过CFSE荧光标记证实后期间充质样细胞确实来源于前期的hAECs。上皮间充质转化与培养体系的关系、上皮间充质转化对hAECs临床应用效果的影响、是否需要控制及如何控制是将来深入研究的方向。

二甲基亚砜作为常用的细胞冻存保护剂，能有效阻止细胞内冰晶的形成而对细胞进行保护，但由于其自身毒性与渗透压的关系，浓度过高也会对冻存细胞造成损伤[24-25]。因此，实验中适中的二甲基亚砜浓度，较好地保证了高水平的复苏细胞存活率。实验发现，随着胎牛血清浓度的提高，复苏细胞存活率也逐渐增加。由此表明，提高胎牛血清的含量有利于复苏后细胞的存活率。正交实验结果显示，1×1010 L-1为最佳的细胞冻存浓度，低于或高于这个浓度细胞复苏活率均下降，推断此细胞浓度与10%二甲基亚砜浓度和体积分数80%血清浓度搭配最为合适，即获得最佳的保护作用，在冻存过程中所受到的损伤为最低。

人羊膜上皮细胞高表达上皮标志角蛋白CK-19，不表达波形蛋白Vimentin[26-

28]。新分离的hAECs除了表达SSEA-4以外，还表达SOX-2、TRA-1-60、TRA-1-81等干细胞表面抗原标志[29]，表达Oct-4和Nanog等多潜能干细胞特定的转录因子，还表达间充质干细胞的某些标志，如CD29、CD90、CD105、CD44等[30-31]。但hAECs内未发现HLA-A、B、C和DR等抗原的表达[32]，由此可见hAECs具有免疫赦免性，移植后可避免免疫排斥反应的发生。

大量临床及临床前研究表明，干细胞具有定向分化能力，在肝脏环境内能分化为肝细胞，可参与肝脏结构的修复和重构，改善肝功能[33]。研究人员发现，肝脏再生需要有干细胞和细胞因子的共同参与[34]。控制干细胞的分化发育，让其分化为肝脏细胞取决于移植细胞与生存微环境的联合作用，其中干细胞生存微环境起重要作用。实验hAECs在体积分数5%胎牛血清的DMEM/F12的培养基中，添加肝细胞生长因子(20 μg/L)、成纤维生长因子(10 μg/L)、胰岛素样生长因子(10 μg/L)与Dex(500 nmol/L)的因子组合，模拟肝细胞分化的微环境，是诱导成功的关键。通过诱导过程中肝细胞表面标志物的荧光染色与诱导后的糖原染色鉴定hAECs是否被成功诱导为肝样细胞。结果表明，hAECs向肝样细胞诱导分化过程中成熟肝细胞特异性标志物表达上升。诱导3周后的hAECs糖原染色表明，诱导后hAECs具有像肝细胞一样的糖元合成能力。研究证明，hAECs在合适的诱导条件下，能够向具有一定功能的肝样细胞进行分化。

hAECs源自废弃的胎盘羊膜组织，细胞来源丰富，拥有类似胚胎干细胞的表达优势，但不像胚胎干细胞研究存在伦理上的争议。研究发现，hAECs细胞中不含有端粒酶，本身不能无地扩增[35-38]，相关研究也证实其不具有致瘤性[39-41]。流式实验中hAECs不表达HLA-DR抗原，与文献中指出的hAECs细胞免疫原性低相吻合。综合上述的优越性与安全性，加上此次实验对其分离培养冻存条件的优化与其向肝样细胞的分化的能力，hAECs有望成为干细胞移植治疗(特别是终末期肝病)优良的细胞来源。

致谢：谨向中国医学科学院血液学研究所应红光副研究员与浙江省血液中心王拥军主任技师表示衷心的感谢。在文章整理修改阶段，得到了两位老师耐心的指导与关怀，两人严谨的科学态度与丰富的科研经验对文章最终成文有很大的贡献，再次表示诚挚的谢意。

作者贡献：除刘超参与此次研究所有过程外，徐志国进行实验设计，实验实施为王绍红、杨旭巍、徐春艳，实验评估为徐志国、程红玲，资料收集为贡波、刘洋，刘超成文，徐志国审校。

利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。

伦理问题：研究用人体组织的实验方案符合相关伦理学要求，文章的撰写与编辑修改后文章遵守了国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。 文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。

作者声明：刘超、徐志国与蔡谨对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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