江苏农业科学２０１３年第４１卷第１Ｏ期 一５３一 唐功，任朝琴，戴先芝，等．辣根过氧化物酶生物印迹与交联［Ｊ］．江苏农业科学，２０１３，４１（１０）：５３—５４ 辣根过氧化物酶生物印迹与交联 唐功，任朝琴，戴先芝，鲜雪梅 （阿坝师范高等专科学校化学化工与生命科学系，Ｉ／￣ｌＪｌｌ汶川６２３００２） 摘要：对辣根过氧化物酶进行生物印迹，最佳模板选择根据检测印迹后酶活力大小来定，并对印迹的辣根过氧化 物酶进行了乙酰化和交联，用三硝基苯磺酸法检测乙酰化和交联的程度。结果表明，以对苯二胺为模板最佳，印迹酶 活性比游离酶增加约１０倍。 关键词：辣根；过氧化物酶；生物印迹；交联 中图分类号：Ｑ５５４ ．６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１３）１０—００５３—０２ Ｒｕｓｓｅｌｌ等发现有机溶剂中酶有一个非常奇特的现象，通 验以ＨＲＰ为印迹对象，以底物及底物类似物为模板，分别对 过配体与酶之间的相互诱导、相互作用可以改变酶的构象，即 ＨＲＰ进行生物印迹，通过检测印迹后酶活力大小来确定最佳 生物印迹 。通过生物印迹提高酶在有机溶剂中的催化活 模板，后对印迹的辣根过氧化物酶进行乙酰化和交联，用三硝 性，增加其作为催化剂的应用，如印迹脂肪酶在手性药物中间 基苯磺酸法检测乙酰化和交联的程度。印迹酶具有抗恶劣环 体的拆分、食品分析、有机合成等过程中，都表现出了较好的 境、高稳定、长寿命、可设计性和催化效率高等特点，为酶的人 催化活性 。辣根过氧化物酶（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ） 工模拟开拓了新的途径。 是一种糖蛋白，以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯 酚、苯胺及其取代物聚合，由于在辣根中含量很高而得名。试 １材料与方法 １．１试剂与仪器 收稿日期：２０１３—０３—０５ 试剂：ＨＲＰ：Ｅｃ１．１１．１．７，２５０ Ｕ／ｍｇ，上海生工；马来酸酐， 基金项目：四川省教育厅２０１１年自然科学重点项目（编号： 江阴市顺飞精细化工厂；乙二醇二甲基丙烯酸酯（ＥＤＭＡ），上 １１ＺＡ１７９）。 海生工；对苯二胺Ｃ．Ｐ，上海生工；偶氮二异丁腈（ＡＩＢＮ）Ａ． 作者简介：唐功（１９７Ｏ一），男，硕士，讲师，主要从事生物化学一酶 Ｒ，上海市四赫维化工有限公司；二甲苯Ａ．Ｒ，天津市巴斯夫 工程研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｄｅｚｔｇ＠１６３．ｔｏｍ。 化工有限公司；对甲苯磺酸Ａ．Ｒ，天津市科密欧化学试剂有 养条件中，３０ ｄ后统计试验结果，结果增殖倍率高达４．８００， ６一ＢＡ对组织培养结果的影响强于ＫＴ，本研究发现植物生长 优于正交试验中的各组，故金线兰根状茎茎段增殖培养最佳 调节物质ＫＴ对根状茎腋芽的增殖作用达到 ＝０．１０的显著 培养条件为：ＭＳ＋６一ＢＡ ３．０ ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ ３．０ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ 影响，而植物生长调节物质６一ＢＡ和ＮＡＡ对根状茎腋芽的 ０．５ ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ ｇ／Ｌ。 诱导作用没有达到显著水平，３种植物生长物质作用强弱依 ３讨论 次是：ＮＡＡ＞６一ＢＡ＞ＫＴ。原因可能为：目前大多数金线兰组 织培养选用的材料为地上茎和原球茎，而本研究采用的试验 根状茎外形与根相似，蔓生于土层下，具有明显的节和节 材料为金线兰地下茎，不同材料部位可能对不同的植物生长 间，叶退化成非绿色的鳞片叶，叶腋中的腋芽或根状茎的顶芽 调节物质的响应程度不同。 可形成背地性之力的地上枝，同时节上产生不定根。根状茎 贮有丰富的营养物质，可存活１年以上，若因耕犁等外力切断 参考文献： 时，茎段上的腋芽仍可再生为新株 ｊ。根状茎比地上茎有更 ［１］中国科学院中国植物志编委会．中国植物志：第１７卷［Ｍ］．北 强的生活力，以根状茎为材料诱导的试管苗可能比以地状茎 京：科学出版社，２０００：２２０． 为材料诱导的试管苗具有更强适应力。相关报道中，以根状 ［２］顾德峰，刘醅，宋彦君，等．蝴蝶兰类原球茎玻璃化产生的原因 茎为材料诱导的试管苗研究较少，笔者报道了金线兰根状茎 及恢复效果研究［Ｊ］．北方园艺，２００７（８）：１８３—１８５． 初代培养研究 ，王建勤等报道了金线兰根状茎增殖培养研 ［３］黄云华，陈庆富．普通养麦植株茎段快速繁殖技术的研究［Ｊ］． 究，他以ＭＳ＋６一ＢＡ ３．０ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ３．０ ｍｇ／Ｌ的培养条件 武汉植物学研究，２００９（４）：４１７—４２２． 获得了５．４倍的增殖倍率 ，比本试验的增殖倍率高０．６，原 ［４］叶创兴，朱念德，廖文波，等．植物学［Ｍ］．北京：高等教育出版 因可能是：（１）王建勤等使用的外植体产自福建省，而本试验 社，２００７：２９． 所用外植体产自贵州省，不同外植体对植物生长调节物质的 ［５］李光，龚宁，周伟香，等．应用正交设计优选花叶开唇兰初代 响应程度不同；（２）王建勤等的试验周期为４５ ｄ，本试验的周 培养基［Ｊ］．种子，２００６（１１）：６９—７１． 期为３０ ｄ，较长的培养时间有利于更多芽的产生。 ［６］王建勤，林兰英，陈钢．药用金线莲根状茎组培育苗研究［Ｊ］． 在金线兰组织培养研究结论中，植物生长调节物质 时珍国药研究，１９９５（１）：３６—３７． －－——５４－——— 江苏农业科学２０１３年第４１卷第１０期 １．２ 限公司；对甲氧基苯甲酸Ａ．Ｒ，中国医药集团化学试剂有限 公司；三硝基苯磺酸（ＴＮＢＳ）Ａ．Ｒ，Ｓｉｇｍａ公司。 仪器：冷冻离心机；真空冷冻干燥机；紫外光聚合仪； ｕＶ一１８００紫外可见分光光度计（日本岛津）；Ｄｉｇｉｌａｂ Ｍｅｒｌｉｎ 订一ＩＲ分光光度计；电子天平；ＬＳＨＺ一３００型水浴恒温振荡 器；Ｈ—ＩＳ—Ｚ型数显恒温水浴锅。 １．２试验方法 ２ １．０ ｇ ０．８ ０．６ ０．４ ０．２ ０ １．２．１印迹酶制备取１５ ｍｇ ＨＲＰ，用０．２ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值为 ５ ｌＯ ２Ｏ ３０ ４Ｏ ７．０的磷酸盐缓冲液１ｍＬ进行溶解，然后加入０．０１ ｍｏｌ／Ｌ模 板，在０ ｏＣ保存４０ ｍｉｎ后，加入２ ｍＬ的二氧六环，温度保持 在一２０℃，搅拌３０ ｍｉｎ，４ ０００ ｒｐｍ冷冻离心机离心１０ ｍｉｎ，弃 时间（ａｉｒｎ） 图１不同模板印迹酶对酶促反应速率的影响 去上清液，沉淀物用二氧六环洗３次，每次３ ｍＬ，真空冷冻干 燥，即得印迹酶（ＮＩＥ）。 １．２．２乙酰化印迹酶制备取２０ ｍｇ ＨＲＰ，用０．Ｏ１ ｍｏｌ／Ｌ、 ｐＨ值为７．８的磷酸盐缓冲溶液５ｍＬ进行溶解，加入模板，在 ０ ｏＣ下保存３０ ｒａｉｎ后，加入６０ ｎａｇ马来酸酐，５ ｍｏｌｆＬＮａＯＨ滴 定，保持ｐＨ值为７．８，搅拌４０ ｍｉｎ后加入２ ｍＬ二氧六环，温 度保持在一２Ｏ ，继续搅拌３０ ｍｉｎ，４０００ｒｐｍ冷冻离心机离心 １５ ｍｉｎ，弃去上清夜，沉淀物用二氧六环溶液洗３次，每次 ３ ｍＬ，真空冷冻干燥，即得乙酰化印迹酶（ＡＩＥ）。 １．２．３交联印迹酶制备取１５ ｍｇ ＨＲＰ，用０．５ ｍＬ二氧六 环溶液进行溶解，振荡得悬液，依次加人０．２５ ｍＬ交联剂 ＥＤＭＡ和５埒甲 ｍｇ引发剂偶氮二异丁腈（ＡＩ－Ｌ ∞Ｏ ∞ Ｏ ０ＢＮ），在３６６ ｎｍ光 照、４℃下聚合５ ｈ，用二氧六环洗涤３次， 加 真空冷冻干燥，即 得交联印迹酶（ＣＬＩ褪游辫 ｛对二Ｅ）。 Ｏ ０ ｍ Ｏ ０ ０ Ｏ １．２．４三硝基苯磺酸法检测游离氨基 。 用过量三硝基 苯磺酸分别与印迹酶（ＭＥ）、乙酰化印迹酶（ＭＥ）、交联印迹 胺 酶（ＣＬＩＥ）作用，剩余的三硝基苯磺酸和过量的Ｌ一缬氨酸反 应，生成淡黄色三硝基苯衍生物，用紫外分光光度计在 ４１０ ｎｍ下进行分析。通过三硝基苯磺酸加入量与测得值的 差，问接测量乙酰化和交联的程度 。具体方法为：苯鞲ｋ氧＿ 称取印 迹酶（ＮＩ酸 Ｅ）、乙酰化印迹酶（ＡＩ攘 Ｅ）、交联印迹酶（ＣＬＩＥ）各 １５ ｍｇ，放置于１０ ｍＩ 棕色瓶中，加入４％ＮａＨＣＯ３￣溶液５ ｍＬ， 振荡５ ｍｉｎ，观察有无聚集体，加入４ ｐ￣ｍｏｌ／ｍＬ三硝基苯磺酸 液５ ｍＬ搅拌，Ｉ然后置于４０ 水浴里，避光反应１ ｈ后，加入 ４０ ｔ￣ｍｏｌ／ｍＬ Ｌ一缬氨酸溶液０．２ ｍＬ，均匀混合后，置于４Ｏ℃ 水浴里，避光反应ｌ ｈ后，用纤维素膜抽滤，取滤液１ ｍＬ，加 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１溶液５ ｍＬ，直至形成稳定的淡黄色三硝基苯 衍生物，用紫外分光光度计在４１０ Ｆｉｎ波长处测定吸光度。 ２结果与分析 ２．１印迹模板选择 由图１可见，与游离酶相比，４种模板印迹后酶活力都有 不同程度的增加，其中以对苯二胺为模板的印迹酶活力增加最 为显著，其次为对甲氧基苯甲酸，这说明印迹后酶的构象发生 了不同程度的变化，新结构更有利于酶一底物复合物的形成。 ２．２游离氨基检测 由图２可见，待测样品印迹酶（ＮＩＥ）、乙酰化印迹酶 （ＡＩＥ）、交联印迹酶（ＣＬＩＥ）中，印迹酶中游离氨基数目最多， 交联印迹酶游离氨基数目最少，这说明酶中一部分游离氨基 与交联化试剂发生了交联化反应，交联过程中酶的一些活性 图２ ＴＮＢＳ法检测游离氨基酸 基团被包埋，交联后游离氨基显著减少。 ３小结与讨论 从ＨＲＰ的结构与作用机制进行分析，在没有Ｈ Ｏ：存在 的情况下，芳香族底物和ＨＲＰ及其一部分衍生物形成１：１ 可逆的杂合体，这一过程主要依靠酶、底物以及酶活性位点水 分子之间的疏水作用力和氢键 。对苯二胺是ＨＲＰ的底物， 它们之间能形成牢固的结合力，使酶的构象发生改变，在除去 底物后有机溶剂中这一构象仍能保持。对于底物类似物对甲 氧基苯甲酸来说，甲氧基中的氧原子以及苯甲酸基团能与 ＨＲＰ中Ａｒｇ的一ＮＨ７形成氢键，同时苯甲酸基团与活性位点 的一个水分子形成氢键，这一结合使酶的构象发生改变，并在 除去配体后的有机溶剂中仍能保持。二甲苯和对甲苯磺酸则 有所不同，除芳香环能与ＨＲＰ活性位点血红素“裸露”边缘 的末梢位点结合外，几乎不能形成其他作用力．．试验结 进 一步证明，以底物对苯二胺为模板的印迹酶活性最高，比游离 酶活性增加约１０倍。另外，ＴＮＢＳ法检测表明，乙酰化和交联 后游离氨基数均减少，证明这种改造酶的方法是可行的 参考文献： ［１］Ｒｕｓｓｅｌｌ Ａ Ｊ，Ｋｌｉｂａｎｖ Ａ Ｍ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８８，２６３ （２４）：１１６２４—１１６２６． ［２］ｌ￣ｃｏｊ Ｍ，Ｔｏｒｒｅ Ｐ，Ｂａｒｅｉｎａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｏｓｓａｕｉｒａｔｙ ｃｈｅｅｓｅ： ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｂｙ ＲＰ ＨＰＬＣ ａｍｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｔｈｅ ＴＢＮＳ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，２０００，１１（１）：７—１１． ［３］Ｖａｎａ Ｓ Ｆ．Ｍｃｃｏｒｍａｅ Ｋ Ｔ．ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｉｎｊｅｃｔｉ０ｎ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｕｓｉｎｇ ２，４，６ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｅ ａｃｉｄ ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｅｔａ，１９９８，３６９（１２）：１６３—１７０． ［４］张朝晖，芦国营．辣根过氧化物酶的结构与作用机制［Ｊ］．生命的 化学，２００５，１（２５）：３３—３６．
