一株产天然蓝色素海洋链霉菌的筛选鉴定

赵辉;闫华晓;王霞;刘明;李富超;秦松

【摘 要】从胶州湾附近海域水样中分离筛选到一株可产生天然蓝色素的链霉菌.采用通用引物16F27/16R1492扩增该菌株的16SrDNA,对测序结果进行序列分析,采用Neighbor-Joining(N-J)法构建系统发育进化树,同时结合链霉菌的传统形态学和生理生化特性对菌株进行鉴定.16SrDNA序列分析表明菌株与Streptomyces violaceolatus KCTC 9772相近,相似率为99%.在Neighbour-Joining法构建的系统发育进化树中,该菌株与Streptomyces violaceolatus聚类在同一分枝上.因此将该菌株鉴定为紫边链霉菌Streptomyces violaceolatus.%One strain of marine streptomyces producing blue pigment from Jiaozhou bay was isolated and identified. 16SrDNA sequence for Actinomycetes strains was amplified by primer pairs 16F27/ 16R1492, the acquired data were used to analyze sequence, and using neighbor-joining method to construct phylogenetic tree. To confirm identification, the morphological, physiological and biochemical properties were also examined. The sequence analysis of 16SrDNA showed that strain sk18 was closely to Streptomyces violaceolatus KCTC 9772 , with the similarity of 99％ . In the phylogenetic tree drawn from neighbor-joining method, strain sk18 and Streptomyces violaceolatus were in the same branch. One strain of marine streptomyces producing blue pigment from Jiaozhou bay was isolated and identified to Streptomyces violaceolatus. 【期刊名称】《生物学杂志》

【年(卷),期】2011(028)003 【总页数】3页(P63-65)

【关键词】天然蓝色素;紫边链霉菌;16SrDNA 【作 者】赵辉;闫华晓;王霞;刘明;李富超;秦松

【作者单位】中国科学院海洋研究所,实验海洋生物学重点实验室,山东,青岛,266071;中国科学院研究生院,北京,100049;山东科技大学生物工程系,山东,青岛,266510;山东科技大学生物工程系,山东,青岛,266510;山东科技大学生物工程系,山东,青岛,266510;山东科技大学生物工程系,山东,青岛,266510;中国科学院海洋研究所,实验海洋生物学重点实验室,山东,青岛,266071;中国科学院海洋研究所,实验海洋生物学重点实验室,山东,青岛,266071 【正文语种】中 文 【中图分类】Q939.5

微生物色素是从微生物中提取出的一种天然色素,不受资源、环境和空间的,具有植物色素和动物色素所不可比拟的优越性[1-2]。利用自然界中微生物发酵生产的色素种类较为丰富,但发酵产生蓝色素却较罕见。蓝色作为自然界的三原色之一,蓝色素也相应具有很高的附加值,它可与红、黄品系的天然色素调配成多种色调。国内外市场天然蓝色素供不应求,开发天然蓝色素在食品、药品、化妆品等领域中具有很大的现实意义和良好的市场前景[3-5]。

本文从胶州湾沿海筛选分离得到一株产生蓝色素的海洋链霉菌菌株,对其进行形态学、生理生化特性和16SrDNA分子鉴定以确定其分类学地位。

1 材料与方法 1.1 菌种分离 1.1.1 样品的采集

水样采自青岛胶州湾海域,并用梯度稀释法处理样品。 1.1.2 选择性培养基

采用改良的高氏 1号培养基:可溶性淀粉 7g、KNO31g、K2HPO4·3H2O 0.45g、MgSO4·7H2O 0.25g、FeSO4·7H2O 0.01g,半海水 1L(500mL海水 +500mL蒸馏水),pH值 7.4。 1.1.3 分离方法

采用双层培养基法,先在平皿内倒一层培养基后再用涂布法将样品涂匀,静置一段时间后再倒入一层培养基。 1.2 试剂与仪器 1.2.1 试剂

可溶性淀粉,琼脂粉,无机试剂均为国产分析纯; Taq酶、10(Taq

Buffer(Mg2+plus)、dNTP mixture、引物对16F27/16R1492均由上海生工生物工程有限公司提供。琼脂糖为 Sigma分装产品。 1.2.2 仪器设备

主要仪器:HZQ-F160全温振荡培养箱(哈尔滨东联电子技术开发有限公司);基因扩增仪 (PCR仪) (Little Genius)(B I OER杭州博日科技有限公司);TG-16-W湘仪微量高速离心机(湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司);JS M-6390扫描电子显微镜 (日本电子公司)。

1.3 产蓝色素的摇瓶发酵优化 1.3.1 培养基

种子培养基:可溶性淀粉 2g;牛肉膏 0.2g;K2HPO4 0.05g;MgSO4·7H2O

0.05g;FeSO4·7H2O 0.001g;pH值7.4。发酵培养基:采用改良的高氏 1号培养基,参照1.1.2。 1.3.2 发酵方法

从斜面上挑取孢子到种子培养基中,250mL三角瓶中装液 100mL、28℃、摇床 220r/min培养 24h,然后以一定的接种量转入摇瓶中,28℃、摇床 220r/min培养150h。

1.4 菌株的培养特征及分类鉴定 1.4.1 培养特征

将海洋链霉菌以三点接种法接种在培养基上28℃培养 7d,观察菌落的质地、菌落的边缘、菌落的表面、纹饰以及菌落颜色等特征。 1.4.2 形态特征

将在培养基上生长的菌落,挑取少许菌丝制片,电镜下观察菌丝的形态、孢子梗的形态、孢子梗的排列与孢子的形态和孢子的着生情况等[6-7]。 1.4.3 生理生化特征

参照《链霉菌菌鉴定手册》[8]进行生理生化特性鉴定。 1.4.4 菌株的 16S rDNA序列测定及系统发育分析

对筛选到的目的菌株进行 16S rDNA的扩增与测序,细菌总 DNA的提取参照文献[7-8],所用通用引物为:引物 1(16F27):AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;引物2(16R1492):GGTTACCTTGTTACGACTT。 PCR反应体系 (体系 25uL):10×buffer 2.5μL,

MgCl2(25mM)1.5μL,dNTP(2.5mM)2.0μL,引物 1 (10uM)1.0μL,引物 2(10uM)1.0μL,模板 DNA 1.0μL,Taq酶 0.5μL,ddH2O 15.5μL。

PCR反应循环参数为:预变性 94℃,10min;变性94℃,40s;退火 49℃,1min;延伸 72℃,2min;进行 30个反应循环;延伸72℃,10min。

PCR产物纯化后经上海生工生物工程技术有限公司测序。根据测序结果,在 NCB I网站中进行BLAST比对分析,选取同源性比较高(>97%)的16S rDNA序列作为参比对象,构建系统进化树。使用 Clustal X1.83软件进行多序列比对,然后采用邻位相接法(Neighbour-joining)利用MEGA4.1(Beta)绘制系统进化树[9-12]。 2 结果与分析 2.1 菌株培养特征

菌株 sk18的固体菌落特征和液体发酵培养特征如图1所示,菌株 sk18的菌丝体在培养基中的表观特征如表1所示。

图1 菌株 sk18的固体和液体培养特征Fig 1 The cultural characteristics of the sk18

表1 菌株 sk-18的培养特征Table 1 The cultural characteristics of the sk18培养基 气生菌丝体 基内菌丝体 可溶性色素高氏 先白色后变为灰色 先橘红后变为蓝色 天蓝色 2.2 菌株形态特征

根据扫描电镜结果(见图 2)可知,sk18的基内菌丝不断裂无横隔,孢子丝波曲至螺旋形,孢子椭圆形,表面光滑。 2.3 菌株生理生化特征

菌株 sk18能很好的利用可溶性淀粉、甘油、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、D-半乳糖、果糖、阿拉伯糖、肌醇、木糖、D-甘露糖、核糖等碳源;能利用大部分氮源;最适生长 pH值 7.0～7.5;最适培养温度为 25～31℃。结果见表2。

图2 菌株 sk18孢子和菌丝体的特征(2500×)Fig 2 Scanning electron micrograph of strain sk18 showing the s mooth surface of spores and mycelium(2500×)

表2 菌株 sk18的生理生化特征Table 2 The physiological and biochemical

characteristics of the strain sk18注:“+”表示反应呈阳性;“-”表示反应呈阴性。生理生化特征 结果 生理生化特征 结果D-葡萄糖D-甘露糖麦芽糖蔗糖淀粉甘油柠檬酸钠D-半乳糖果糖阿拉伯糖核糖++++++-+++-肌醇木糖D-甘露糖脂肪酶氧化酶过氧化氢酶纤维素酶明胶液化盐还原H2S产生++++-++++- 图3 利用Neighbor-Joining(邻近法)构建的 16SrDNA系统发育进化树Fig 2 Phylogenetic tree drawn from neighbor-joining analysis based on the 16SrDNA sequence alignment 2.4 系统发育分析结果

通过 PCR方法扩增菌株 sk18的 16SrDNA序列,并在 Genbank中进行在线BLAST分析,发现与 Streptomyces violaceolatusKCTC 9772的相似率为 99%,并在Genbank上登录注册,sk18的注册号为 GU075926。根据测序结果,在NCBI网站中进行BLAST比对分析,以属于放线菌的诺卡式菌属的一株菌为外群,以同源性比较高(>97%)的链霉菌 16S rDNA序列作为参比对象,构建系统进化树。使用 Clustal X1.83软件进行多序列比对,然后采用邻位相接法(Neighbour-joining)利用MEGA4.1(Beta)绘制系统进化树,自展数 (bootstrap)为 1000。结果如图 3。 3 结论与讨论

食用色素是以食品着色和改善食品色泽为目的的食品添加剂。随着社会的发展和科技的进步,消费者更加青睐纯天然的食品添加剂,天然色素在市场上的份额也迅速增加。研究开发无毒的天然食用色素已成为食用色素发展的总趋势。海洋微生物生活在特殊环境中,是多种新颖化合物的极好资源[13-15]。

通过对所得目的菌株进行形态学观察、生理生化鉴定和分子生物学鉴定确定其为一株海洋紫边链霉菌Streptomyces violaceolatus,它可稳定产生蓝色素,色素色泽纯正,对于该菌所产生色素的性质、安全性、化学结构和生物学合成机理有待进一步研究,以便探讨该蓝色素是否可作为食品添加剂应用于食品当中。

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