一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法[发明专利]

*CN103266100A*

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103266100 A(43)申请公布日 2013.08.28

(12)发明专利申请

(21)申请号 201310156261.8(22)申请日 2013.04.27

(71)申请人福建省农业科学院农业生物资源研

究所

地址350000 福建省福州市路247号(72)发明人刘波 车建美 唐建阳 葛慈斌(74)专利代理机构福州市鼓楼区京华专利事务

所(普通合伙) 35212

代理人宋连梅(51)Int.Cl.

C12N 13/00(2006.01)C12N 1/06(2006.01)C12R 1/13(2006.01)

权利要求书1页 说明书7页 附图3页权利要求书1页 说明书7页 附图3页

()发明名称

一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法(57)摘要

本发明提供一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法，将短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的种子液按1%比例接种于发酵罐中，30℃下发酵48h；将发酵液置于6000rpm/min离心15min，弃上清，收集菌体，用超纯水反复洗涤菌体4次；将菌体与超纯水混合，于超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎；且细胞破碎的条件为：超声波功率为318.68W；超声时间0.5s，间歇时间1.5s，循环进行且超声总历时10min；料液比为1:25；乙酸乙酯萃取细胞破碎后菌体悬浮液，旋转蒸发以获得胞内物质干重。本发明填补了现有技术中对短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX胞内物质提取的空白，且破碎率高。CN 103266100 ACN 103266100 A

权 利 要 求 书

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1.一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法，其特征在于：该方法具体包括如下步骤：

步骤一：将短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的种子液按1%比例接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，30℃下发酵48h；

步骤二：将步骤一获得的发酵液置于6000rpm/min离心15min，弃上清，收集菌体，并用超纯水反复洗涤菌体4次；

步骤三：将步骤二最终收集的菌体与超纯水混合，置于超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎；且细胞破碎的条件为：超声波功率为318.68W；超声时间0.5s，间歇时间1.5s，循环进行且超声总历时10min；料液比为1:25；

步骤四：利用乙酸乙酯萃取步骤三细胞破碎后所得的菌体悬浮液，之后将所得萃取液进行旋转蒸发以获得胞内物质干重。

2.根据权利要求1所述一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法，其特征在于：所述LB液体培养基的组分为：胰蛋白胨1%，牛肉浸膏0.5%，NaCl0.5%，超纯水配制，pH7.0-7.2；且该培养基组分的百分比为质量百分比。

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说 明 书

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一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法

【技术领域】

[0001] 本发明涉及一种生物领域的超声破碎方法，尤其涉及一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法。

【背景技术】

[0002] 短短芽孢杆菌是一类革兰氏染色阳性或可变、菌体杆状、以周生鞭毛运动、产芽孢的一类细菌。本申请人已于2010年09月29日申请的中国发明申请号为CN2010102937.6、名称为“一种新的短短芽孢杆菌菌株及其应用”中揭露了“短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX”，其于2010年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且保藏编号为CGMCC No.4115；该短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX（Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX）是从福建省永泰县的西瓜根际土壤中分离并筛选得到具有拮抗作用的菌株，该菌对大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、黑白轮枝菌（Verticillium alboatrum）、真菌轮枝霉（Verticilium fungicola）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、桃褐腐丛梗孢（Monilialaxa）和青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）等多种病原菌显示出较强的拮抗活性（记载于葛慈斌等.2009.福建农业学报，24（1）：29-34）。目前普遍认为，短短芽孢杆菌的抑菌机理主要是菌体可以产生短杆菌肽和几丁质酶等活性物质。短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX胞外物质具有较强的稳定性，胞外物质于60-80℃温育1h抑菌活性保持在88.5%以上，在酸性pH3.0-5.0和碱性pH9.0-10.0条件下，抑菌活性保持在77.2%以上，对蛋白酶K、光照、紫外照射等均不敏感（记载于郝晓娟等，2007.浙江大学学报（农业与生命科学版），33（5）：484-4）。

[0003] 胞内物质的种类与细胞的生理代谢密切相关，短短芽孢杆菌FJAT-0809-GLX胞外物质特性已有报道，但胞内物质研究还未见报道。研究胞内物质第一步是进行细胞破碎，短短芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其细胞壁较厚，肽聚糖网状结构较致密，破碎具有一定的难度。目前广泛采用的菌株的破碎方法有高速匀浆法、高速珠磨法、酶学法、化学渗透法、微波细胞破碎、超声波细胞破碎等，各种方法都有其的适用范围和优缺点。其中，超声波细胞破碎方法的超声波频率高、波长短，因此在一定距离内具有较强的方向性和穿透性，易于获得较集中的声能，利于细胞破碎；超声波的作用机制主要包括热学机制、机械粉碎机制、空化作用和化学效应。超声波辅助提取法在中草药有效成分的提取和分离应用广泛，但超声波细胞破碎法提取短短芽孢杆菌菌株胞内物质的研究还未见报道。

【发明内容】

[0004] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种破碎率高的短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种短短芽孢杆菌菌株胞内物

质提取的超声波破碎方法，该方法具体包括如下步骤：

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说 明 书

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步骤一：将短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的种子液按1%比例接种于装有LB

液体培养基的发酵罐中，30℃下发酵48h；[0007] 步骤二：将步骤一获得的发酵液置于6000rpm/min离心15min，弃上清，收集菌体，并用超纯水反复洗涤菌体4次；[0008] 步骤三：将步骤二最终收集的菌体与超纯水混合，置于超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎；且细胞破碎的条件为：超声波功率为318.68W；超声时间0.5s，间歇时间1.5s，循环进行且超声总历时10min；料液比（即最终所收集菌体与超纯水的比例）为1:25；[0009] 步骤四：利用乙酸乙酯萃取步骤三细胞破碎后所得的菌体悬浮液，之后将所得萃取液进行旋转蒸发以获得胞内物质干重。[0010] 进一步地，所述LB液体培养基的组分为：胰蛋白胨1%，牛肉浸膏0.5%，NaCl0.5%，超纯水配制，pH7.0-7.2；且该培养基组分的百分比为质量百分比。[0011] 本发明的有益效果在于：提供了一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法，填补了现有技术中对短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX胞内物质提取的空白，尤其是其超声波破碎方面的空白；且本发明还具有破碎率高的特点，能够极大地提高所获得短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX胞内物质的量。

【附图说明】

[0012] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。[0013] 图1是本发明中响应面法（超声波功率、料液比）等高线分析图。[0014] 图2是本发明中响应面法（超声波功率、料液比）立体分析图。图3是本发明中响应面法（超声波功率、超声时间）等高线分析图。[0016] 图4是本发明中响应面法（超声波功率、超声时间）立体分析图。[0017] 图5是本发明中响应面法（超声时间、料液比）等高线分析图。[0018] 图6是本发明中响应面法（超声时间、料液比）立体分析图。

[0015]

【具体实施方式】[0019] 本发明中“短短芽孢杆菌菌株”指的是本申请人于2010年09月29日申请的中国发明申请号为CN2010102937.6、名称为“一种新的短短芽孢杆菌菌株及其应用”中所揭露的“短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX”，其于2010年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且保藏编号为CGMCC No.4115。为了方便阐述，以下将该短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX简称为菌株FJAT-0809-GLX。[0020] 1材料

[0021] 1.1菌株：短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX。[0022] 1.2试剂与仪器[0023] （1）试剂：LB液体培养基：胰蛋白胨1%，牛肉浸膏0.5%，NaCl0.5%，超纯水配制，pH7.0-7.2，且该培养基组分的百分比为质量百分比；乙酸乙酯为分析纯级别。[0024] （2）仪器：离心机、超声波细胞破碎仪、旋转蒸发仪、电子天平。[0025] 2试验方法

[0026] 2.1单因素条件摸索

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说 明 书

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[0027] （1）将菌株FJAT-0809-GLX进行活化以获得菌株FJAT-0809-GLX的单菌落，之后

将该菌株FJAT-0809-GLX的单菌落接种于100mL LB液体培养基中，于30℃、170rpm/min条件下过夜培养得种子液；将所得种子液按1%接种量转接到装有LB液体培养基的发酵罐中，30℃下发酵48h，发酵结束后6000rpm/min离心15min，弃上清，收集菌体；并用超纯水反复洗涤菌体4次。[0028] （2）超声波细胞破碎单因素条件摸索[0029] a、超声功率梯度设置：料液比1:15；超声时间0.5s，间歇时间1.5s，循环进行且超声总历时30min；超声波功率分别是100W、300W、500W、700W、900W。[0030] b、料液比（料指的是菌体、液指的是超纯水）的梯度设置：超声时间0.5s，间歇时间1.5s，循环进行且超声总历时30min；超声波功率为500w；料液比设置为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25。[0031] c、超声总历时梯度设置：料液比1:15；超声波功率为500w；超声时间0.5s，间歇时间1.5s，循环进行且超声总历时设置为10min、20min、30min、40min、50min。[0032] 2.2短短芽孢杆菌菌株胞内物质的提取与测定[0033] 将反复洗涤4次后的菌体与超纯水混合，置于超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，且细胞破碎的条件如“（2）超声波细胞破碎单因素条件摸索”中所设定；之后利用乙酸乙酯萃取细胞破碎后所得的菌体悬浮液，之后将所得萃取液进行旋转蒸发，计算所得物质的量即得胞内物质干重。[0034] 2.3响应面试验设计

[0035] 以胞内物质干重为选择标准，选出较优单因素条件进行响应面设计，进而获得最优破碎条件。

[0036] 3结果与分析

[0037] 3.1不同超声波条件下所得物质质量的显著差异分析[0038] 3.1.1超声总历时对胞内物质提取的影响[0039] 不同超声总历时所得物质的质量见表1，由表1数据显示，超声总历时为30min时获得物质是超声总历时各梯度设置中最多的，10-30min物质质量随超声总历时的增加而增加，即随超声总历时的延长细胞破碎越充分，从而使胞内物质质量升高；而30-50min物质质量随超声总历时的增加而减少，由于超声时间30min时细胞已经破碎的很充分，而超声总历时的延长，使胞内大分子物质化学键、氢键发生断裂，形成小分子物质或者不溶于水的物质，导致物质质量降低。

[0040] 表1不同超声总历时所得物质质量差异分析

[0041]

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说 明 书

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3.1.2超声波功率对胞内物质提取的影响

[0043] 不同超声波功率所得物质的质量见表2，由表1数据可看出，超声波功率为100W时，所得物质平均值最高，为0.28g；超声波功率高于300W，随超声波功率的增加，所提取胞内物质质量没有明显变化。

[0044] 表2不同超声功率所得物质质量差异分析

[0042] [0045]

3.1.3料液比对胞内物质提取的影响

[0047] 不同料液比所得物质的质量见表3，由表3可知，随着料液比的降低，所提取胞内物质质量增加，当料液比1:25时所得物质质量最高，为0.39g；料液比1:15和1:20时，所得物质质量基本相同，即料液比为1:15和1:20时较稳定，因此，料液比1:15和1:20较合适。

[0048] 表3不同料液比所得物质质量差异分析

[0046] [0049]

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说 明 书

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3.1.4不同条件下物质质量显著性分析

[0051] 通过上述试验方法所获得的胞内物质经DPS数据处理软件进行差异显著性分析，得知，在1%显著水平上，均无差异，在5%的显著水平上，超声总历时30min所得物质的质量显著高于其他超声时间；在5%显著水平上，料液比为1:25时获得的物质质量显著高于其他料液比；超声波功率对所的物质质量未表现出显著差异。[0052] 3.2响应面法优化超声波破碎条件及结果[0053] 3.2.1响应面试验设计

[00] 响应面分析法是目前应用较多的条件优化方法，它将图形技术与函数关系有机的结合，我们可以直观的看出试验的最优条件，与其他试验方法相比，响应面试验法不仅能够找出最优值，而且可以直观看出最优区域。[0055] 本申请以单因素试验结果为基础，进行响应面试验设计，选取超声总历时、超声波功率和料液比作为3个影响因素，采用3因素3水平响应面分析法，试验因素及水平的取值见表4，应用统计软件Design-expert软件设计试验并进行结果分析，试验矩阵及结果见表5。

[0056] 表43因素和3水平的取值

[0057]

[0058] [0059]

表5试验矩阵及结果

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3.2.2二次回归模型的建立

[0061] 利用Design-Expert软件对表5中的数据进行多元回归拟合，以菌株FJAT-0809-GLX的胞内物质产率（Y）为响应值，超声波功率（Ａ）、超声总历时（B）和料液比（C）为试验因子，进行二次多项回归模型拟合，得到如下二次多项回归模型：

2

[0062] Y=11.30-1.33A-1.52B-1.86C-4.85A2-3.20B-0.34C2-0.AB+4.05AC+3.29BC[0063] 式中，Y为胞内物质产率；A、B、C分别代表超声波功率、超声总历时和料液比。该模型R2=0.9724，表明该模型的拟合程度较好，可以解释97.24%响应值变化。[00] 3.2.3回归模型方差分析

[0065] 对上述二次回归模型的方差进行分析，结果见表6，由表6的分析结果显示，超声总历时、超声波功率和料液比3个因素在细胞破碎过程中均起作用，且对提取率即胞内物质产率的影响，料液比>超声总历时>超声波功率，超声波功率与料液比间的交互作用较明显，超声总历时与料液比的交互作用亦较显著，仅超声功率与超声总历时的交互作用不显著。

[0066] 表6回归模型的方差分析

[0060] [0067]

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说 明 书

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3.2.4响应面的分析

[0069] 通过上述二次多项回归模型拟合方程作相应的响应面法立体分析图和等高线图，所作的响应面法立体分析图和等高线图分别如图1至图6所示，各图中的等高线直观的反映各因素间的交互作用，等高线呈现圆形和椭圆形，圆形的等高线表明2个因素的交互作用较小，可忽略，椭圆形的等高线表明2个因素的交互作用显著。[0070] 参照图1至图6可知，料液比与超声总历时、料液比与超声波功率的交互作用较显著，而超声总历时与超声波功率的交互作用不显著；根据单因素条件摸索为基础，应用响应面试验设计软件，设计并分析得到最优细胞破碎条件为：超声波功率为318.68W，超声总历时为10min，料液比为1:25，理论预测胞内物质产率为13.3586mg/g，根据预测最优条件进行验证，理论胞内物质产率为12.9878mg/g，相对标准偏差为0.0687，因此采用响应面分析法分析得到的最优破碎条件较可靠。[0071] 综上，本发明提供一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法，填补了现有技术中对短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX胞内物质提取的空白，尤其是其超声波破碎方面的空白；且本发明中采用最优细胞破碎条件从而使得其具有破碎率高的特点，进而能够极大地提高所获得短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX胞内物质的量。

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说 明 书 附 图

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图1

图2

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说 明 书 附 图

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图3

图4

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说 明 书 附 图

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图5

图6

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