冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗及制备方法[发明专利]

[12]发明专利申请公开说明书

[21]申请号98123771.1

[51]Int.CI7

A61K 39/29A61K 9/19

[43]公开日2000年5月10日[22]申请日98.10.28

[21]申请号98123771.1

[11]公开号CN 1252308A

[74]专利代理机构浙江工业大学专利事务所

代理人袁木棋 高丽敏

[71]申请人浙江省医学科学院普康生物技术公

司

地址310013浙江省杭州市天目山路60号[72]发明人柴少爱 陈念良 毛江森 高丽美 钱汶

黄海鹰 张峰 陈卓 忻亚娟 毛子安 黄伟新 王平 袁建国 庄昉成

权利要求书 1 页 说明书 4 页

[]发明名称

冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗及制备方法[57]摘要

一种冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗及制备方法,其疫苗包含有明胶、乳糖、硫酸镁、氯化镁组成的甲型肝炎冷冻干燥保护剂和MEM氨基酸基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液溶液,将甲肝病毒液按一定比例加入到上述含有甲型肝炎病毒冷冻干燥剂的MEM氨基酸基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液溶液中,采用真空冷冻干燥,即制成冷冻干燥甲肝减毒活疫苗,工艺合理,安全性和稳定性好,有效期长达18个月,预防甲肝效果好,具有重大社会经济效益和实施价值。

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权 利 要 求 书

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1、冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗，其特征是疫苗中包含有明胶、乳糖、硫酸镁、氯化镁组成的甲型肝炎病毒冷冻干燥保护剂和基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液。

2、如权利要求1所述的疫苗，其特征是甲型肝炎病毒冷冻干燥保护剂组成为：明胶，疫苗中终浓度为0.1-0.5克％，乳糖，疫苗中终浓度为3.0-6.5克％，硫酸镁，疫苗中终浓度为0.1-0.25克％，氯化镁，疫苗中终浓度为0.3-0.45克％。 3、如权利要求1所述的疫苗，其特征是基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液为可耐高温灭菌的基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液。

4、如权利要求1或3所述的基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液，其特征是该平衡盐溶液PH值为7.0-7.4。

5、如权利要求1所述的冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗的制备方法，其特征是100毫升去离子蒸馏水中加入基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐0. 94克，待溶解后加入明胶0.1-0.5克，将该溶液水溶温热，待明胶充分溶解后再加入乳糖3.0-6.5克，然后加入用去离子蒸馏水溶解好的硫酸镁0.1-0.25克和氯化镁0.3-0.45克，再将甲肝病毒浓缩液按每人份接种病毒量6.5-7.0log10TCID50比例加入到上述含有甲型肝炎减毒活疫苗冷冻干燥剂的基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液中进行灌装，采用真空低温冷冻干燥法，冷冻干燥箱预冷至-20℃-40℃疫苗进箱，冻干箱搁板温度为-35℃-50℃时，开真空、升华，二次干燥真空冷冻干燥箱搁板温度为15℃-30℃，即制成冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗。

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说 明 书

冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗及制备方法

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本发明属于甲型肝炎减毒活疫苗及制备方法，尤其是冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗及制备方法，适用于预防人体甲型肝炎的减毒活疫苗及制备的场合。 病毒性肝炎是我国最主要的传染病，而甲型肝炎占已知六种病毒性肝炎发病率的首位。自1992年以来，全国已有近一亿人接种液体剂型的甲型肝炎减毒活疫苗，获得了非常满意的流行病学保护效果。甲肝的年发病率平均每年以20％左右的速度下降。但是，由于我国处于发展中国家，许多边远地区交通仍然不便，而一般的液体剂型甲型肝炎减毒活疫苗在4-8℃条件保存有效期只有3个月。含有稳定剂的液体剂型甲型肝炎减毒活疫苗在4-8℃条件保存有效期也仅有6个月。到目前为止，国外尚未有大规模应用于人体的甲型肝炎减毒活疫苗以及冻干剂型的甲型肝炎减毒活度苗。而国内含有疫苗保护剂的使用真空冷冻干燥方法制造而成的、4-8℃保存有效期达18个月的冻干甲型肝炎减毒活疫苗至今未有报告。

根据我国国情，为控制甲型肝炎的流行，接种甲型肝炎减毒活疫苗是一种行之有效的方法。因此，须使广大的人群，特别是农村人群都能接种到安全的、免疫原性强的、高效的甲型肝炎减毒活疫苗。

本发明的目的就在于提供一种安全、高效、稳定性好、有效期长的甲型肝炎减毒活疫苗新剂型-即含有冷冻干燥保护剂的冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗及制备方法。

本发明的冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗，疫苗中包含有明胶、乳糖、硫酸镁、氯化镁组成的甲型肝炎病毒冷冻干燥保护剂和基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液。 甲型肝炎病毒冷冻干燥保护剂组成为：明胶，疫苗中终浓度为0.1-0.5克％，乳糖，疫苗中终浓度为3.0-6.5克％，硫酸镁，疫苗中终浓度为0.1-0.25克％，氯化镁，疫苗中终浓度为0.3-0.45克％。

基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液为可耐高温灭菌的基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液。

基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液的PH值为7.0-7.4。

冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗的制备方法。每100毫升去离子蒸馏水中加入基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液0.94克。待溶解后加入明胶0.1-0.5克。将该溶液温热、待明胶充分溶解后再加入乳糖3.0-6.5克，然后加入、用去离子蒸馏水溶解好的硫酸镁0.1-0.25克和氯化镁0.3-0.45克，过滤，分装，蒸气高压灭菌。再将甲肝

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98123771.1说 明 书 第2/4页

病毒浓缩液按每人份接种病毒量6.5-7.0log10TCID50比例加入到上述含有甲型肝炎减毒活疫苗冷冻干燥保护剂的基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液中进行灌装，采用真空冷冻干燥法，冷冻干燥箱预冷至-20℃-40℃疫苗进箱，冻干箱搁板温度为-35℃-50℃时，开真空、升华，二次干燥真空冷冻干燥箱搁板温度为15℃-30℃，即制成冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗。

本发明的冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗及制备方法，与现有技术相比，工艺合理，安全性和稳定性好，有效期长，通常4-8℃保存有效期可达18个月，预防甲肝效果好，具有重大社会经济效益和实施价值。

本发明的冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗及制备方法，其实施方案为：疫苗中包含有明胶、乳糖、硫酸镁、氯化镁组成的甲型肝炎病毒冷冻干燥保护剂和基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液溶液。

甲型肝炎病毒冷冻干燥保护剂组成为：明胶，疫苗中终浓度为0.1-0.5克％，乳糖，疫苗中终浓度为3.0-6.5克％，硫酸镁，疫苗中终浓度为0.1-0.25克％，氯化镁，疫苗中终浓度为0.3-0.45克％。

基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液为可耐高温灭菌的基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液。

基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液的PE值为7.0-7.4。

冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗的制备方法，每100毫升去离子蒸馏水中加入基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液0.94克，待溶解后加入明胶0.1-0.5克，将该溶液温热，待明胶充分溶解后再加入乳糖3.0-6.5克，然后加入用去离子蒸馏水溶解好的硫酸镁0.1-0.25克和氯化镁0.3-0.45克，达滤，分装，蒸气高压灭菌。再将甲肝病毒浓缩液按每人份接种病毒量6.5-7.0log10TCID50比例加入到上述含有甲型肝炎减毒活疫苗冷冻干燥剂的基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液中进行灌装，采用真空冷冻干爆法，冷冻干燥箱预冷至-20℃-40℃疫苗进箱，冻干箱搁板温度为-35℃-50℃时，开真空、升华，二次干燥真空冷冻干燥箱搁板温度为15℃-30℃，即制成冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗。 实施例1：

将含有疫苗冻干保护剂的甲型肝炎减毒活疫苗，按每人份分装量0.5-1.2ml、内含病毒量6.5-7.0log10TCID50，一部分加塞压盖4℃保存作为疫苗冻干前感染性滴度检测用，另一部分疫苗将丁基胶并塞加至1/3处，再进行冷冻干燥。五个不同批号含有疫苗冻干保护剂的甲肝减毒活疫苗经冷冻干燥后，感染性滴度检测证明：按本发明权利要求1的方法冷冻干燥制成的冻干甲型肝炎减毒活疫苗，疫苗冷冻干燥后感染性滴度比冷冻干燥前仅下降在0.26-0.41log10TCID50/ml之同。(附表1)

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98123771.1说 明 书 第3/4页

表1：    甲肝减毒活疫苗冻干前后感染性滴度测定

logTCID50/ml

疫苗批号

冻干前

96A296A397A1198A398A4

6.917.006.766.506.66

冻干后6.507.176.456.186.40

前后差0.41-0.270.310.320.26

实施例2：

同一批号的，含有明胶、乳糖、氯化镁、硫酸镁、基础氨基酸培养基(MRM)平衡盐溶液的甲肝减毒活疫苗冻干苗和未经冻干的液体对照苗，存放在同一个4-8℃冰箱内，定期随机取样测定疫苗感染性滴度，结果证明：按本发明权利要求1方法冷冻干燥制成的冻干甲型肝炎减毒活疫苗，具有良好的稳定性，在4-8℃条件下存放21个月，疫苗感染性滴度不变。而未经冷冻干燥的液体对照苗在4-8℃存放21个月感染性滴度明显下降，达到1.41log10TCID50/ml。本结果同时证明：未经冷冻干燥的液体对照苗在4-8℃条件下存放10个月的感染性滴度与冻干苗存放24个月的感染性滴度下降幅度相近。(附表2)

表2：    冻干甲肝减毒活疫苗4-8℃保存感染性滴度测定疫苗logTCID50/ml

疫苗批号

0月

液体苗冻干苗

6.926.50

2月6.506.50

6月6.666.50

10月6.136.50

13月5.756.63

17月5.836.75

21月5.506.55

4月5.336.20

实施例3：

将含有明胶、乳糖、氯化镁、硫酸镁基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐溶液冻干保护剂的甲肝减毒活疫苗和不含有明胶、乳糖、氯化镁、硫酸镁基础氨基酸培养基(MEM)平衡盐保护剂，用PBS缓冲液稀释的甲肝减毒活疫苗，在同一真空冷冻干燥条件下进行冷冻干燥，然后随机取样测定疫苗感染性滴度。结果证明未加保护剂的疫苗经冷冻干燥后，病毒活力大部分丧失。(附表3)

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98123771.1说 明 书 第4/4页

表3：    冻干保护剂对甲肝减毒活疫苗感染性滴度的影响

log10TCID50/ml

疫苗批号

保护剂

液体(对照)苗(3.50

9807-1

-3.576.57

9807-1

+

6.50

6.506.296.50冷冻干燥苗6.29

实施例4：

将含有冷冻干燥剂批号为96A2冷冻干燥甲型肝炎减毒活疫苗，接种于79例甲型肝炎病毒抗体(抗HAV-lgG抗体)阴性的6-7岁小学一年级学生，接种方法为上臂皮下注射1.0ml，疫苗病毒含量为6.50log10TCID50/ml。冷冻干燥苗临用前用灭菌注射用水溶解。疫苗接种8周后抽上臂静脉血清抗甲型肝炎病毒抗体(抗HAV-lgG抗体)结果表明：79例冻干苗接种者中有72例甲肝病毒抗体(抗HAV-lgG抗体)检验呈阳性，抗体阳转率为91.14％。

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