实验一 植物组培无菌操作

实验一 植物组培无菌操作技术

实验目的

1 了解植物组织培养技术原理

2、熟悉外植体预处理方法，掌握消毒和接种方法

实验原理

1、植物组织培养的过程：将外植体（ explant ）植物的任何器官、 组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。

2、植物组织培养的理论基础：

植物细胞具有全能性（totipotency ）；是将外植体（ explant ）植物的任何器官、 组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。

细胞分化(cell differentiation)：一个成熟的种子都含有一个胚胎。构成胚胎的所有细胞几乎都保持着未分化状态和旺盛的细胞能力，这种细胞叫做胚性细胞，或叫做分生性细胞。

随着种子的萌发，胚胎细胞开始，细胞也随之发生形态及功能的变化，并分別发育成植物的根、茎、叶等组织、器官。细胞在形态及结构上所发生的永久性变化过程称之

为细胞分化。

脱分化或逆分化(dedifferentiation)：由失去能力的细胞回复到分生状态，并进行形成没有分化的细胞团的过程称细胞的脱分化(dedifferentiation) ；这种没有分化的细胞团称之为愈伤组织 (callus) 。

再分化(redifferentiation)：由无分化的愈伤组织细胞再转变为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，并构成一个完整的植物奇怪或植物体的过程称细胞的再分化。一个已分化细胞要表的出其全能性，就要经过脱分化和再分化的过程，这就是植物组培和细胞培养所要达到的目的。

3、无菌操作

由于组织培养用的植物材料，大多数由幼嫩组织组成，这些组织离开母体后，生存能力弱，很容易受细菌的感染而死亡。因此要使这些离体的材料能够生存和繁殖，必须防止细菌感染，做到无菌培养。组织培养的培养基营养丰富，真菌和细菌一旦繁殖起来，比植物细胞生长快得多，很快就会将养分耗尽，使植物得不到营养，同时还要浸染植株，使之受到损害。所以，培养基、培养用具都必须灭菌。在组织培养过程中，涉及培养瓶、培养基、器皿、材料、接种工具、操作环境、培养室和工作台面等的灭菌，都要保证无菌，才能达到无菌的目的。

实验步骤

1 外植体预处理：当年生萌动状态的饱满嫩枝作为外植体，剪去所取杉木茎段的叶片，用自来水冲洗干净。

2、消毒：a 5%洗衣粉浸泡5分钟，自来水以流水冲洗干净1h；b 蒸馏水冲洗3-5次，置超净工作台备用；c 用75%酒精浸泡30秒后；d 0.1%升汞溶液消毒10min；无菌水冲洗6遍。

3、接种：

a 培养瓶灭菌：将培养瓶拿成斜角，使瓶口在酒精灯火焰上方灼烧数秒。

b用灼烧过的冷却的镊子取外植体材料转接到培养瓶中，轻轻插入培养基；

c 接种完毕，将瓶口在火焰上转动灼烧，封口。

d 操作期间，经常用70%酒精擦拭工作台和双手，镊子反复在95%酒精中浸泡和火焰上灼烧灭菌。

注意事项

1接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中

2整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速

3防止操作带来的污染，接种过程中尽可能达到悬空要求

4接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口

5 瓶盖朝上放置，接种完毕立即盖好瓶口

6 接种完一瓶用火灼烧镊子或接种针防止交叉污染

7 种子或分生组织培养，贴放培养基表面，不是插到内部，防止供氧不足

8 接种茎段，注意形态学下端插入培养基内，形态学上端露于空气中

实验小结

本次实验讲解了植物组织培养的原理，要求学生理解组培的理论基础，以及通过实验，熟练掌握外植体处理和消毒接种技术。