维普资讯 http://www.cqvip.com 解放军药学学报第２４卷第４期丹参中丹酚酸Ｂ纯化工艺研究 高声传 ・３０７・ 能够通过调控ｐ２１基因使Ａ５４９细胞周期停滞，从 Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ，２００３，３０７（２）：７２０ 而诱导Ａ５４９凋亡。 ［４］ Ｋｕｍｍａｒ Ｓ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ｍ，Ｇａｒｄｎｅｒ ＥＲ，ｅｔ ａ１．Ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ＭＳ一 ２７５，ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｅｅｋｌｙ ｉｎ ｒｅ— ＨＤＡＣ抑制剂能够通过内源性细胞凋亡信号途 ｆｒａｃｔｏｒｙ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ 径诱导细胞死亡，ＨＤＡＣ抑制剂主要是下调了ｂｃｌ一２ Ｒｅｓ，２００７，１３（１８）：５４１１ 家族的抗凋亡蛋白，如Ｂｃｌ一２、Ｂｃｌ—ｗ等 。。。本研究中 ［５］ ＧｌａｚｅｒＫＢ，ＳｔａｖｅｒＭＪ，Ｗａｒｉｎｇ ＪＦ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ 抗凋亡基因ＢＣＬ２Ｌ２等明显下调，表明ＭＳ一２７５可能 ｍｕｌｉｔｐｌｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ（ＨＤＡＣ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｄｅｆｉｎｉｎｇ ａ ｃｏｎｌｌｕｏｎ 通过内源性细胞凋亡信号通路诱导Ａ５４９细胞凋亡。 ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ＨＤＡＣ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｔ２４ ａｎｄ ＭＤＡ ｃａｒｃｉｎｏｍａ 对于活体和离体条件下的转化细胞，ＨＤＡＣ抑制剂都 ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２ＯＯ３，２（２）：１５１ 能够上调死亡受体和配体的表达等外源性细胞凋亡 ［６］ ＳｃｈｒｏｅｄｅｒＴＭ，Ｎａｌｒ ＡＫ，Ｓｔａｇｇｓ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｓｔｅｏｂｌｓａｔ ｇｅｎｅｓ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉｌａｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎ— 信号 。在本研究中，死亡受体ＤＲ６以及ＦＡＳ通路 ｈｉｂｉｔｏｒｓ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００７，３６２（８）：１ （ＦＡＳＴＫ）被明显上调，表明ＭＳ一２７５也可能通过外源 ［７］ ＬｅｅＨ，Ｌｅｅ Ｓ，Ｂａｃｋ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ 性细胞凋亡信号通路诱导Ａ５４９细胞凋亡。 Ａ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｅｔｔ，２０Ｏ２，２４（５）：３７７ 另外，本研究还发现许多细胞周期蛋白以及与 ［８］ Ｍａｒｉａｄａｓｏｎ Ｊ，Ｃｏｍｅｒ Ｇ，Ａｕｇｅｎｌｉｃｈｔ Ｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｉｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｃ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ 细胞周期进程（如ＤＮＡ复制与损伤修复）相关的基 ａｃｉｄｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ，ｓｕｌｉｎｄａｃ，ａｎｄ ｃｕｍｕｍｉｎ 因被抑制，如：ＣＣＮＡ２／Ｅ２／Ｔ２，ＴＯＰ２Ａ／２Ｂ，ＲＡＤ等， ｎａｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ 这些基因的表达下调也延缓了细胞的增殖。ＭＳ一 Ｒｅｓ，２０００，６０（１６）：４５６１ ２７５通过何种机制调控这些细胞周期相关基因的表 ［９］ Ｖｉｄａｌ Ａ，Ｋｏｆｆ Ａ．Ｃｅｌｌ—ｃｙｃｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｔｈｒｅｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｕｎｉｔｄｅ ｂｙ ａ 达还有待进一步研究。 ｃｏｍｍｏｎ ｃａｕｓｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２０００，２４７（１）：１ ［１Ｏ］ ｘｕ Ｗ，Ｎｇ０ Ｌ，Ｐｅｒｅｚ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ 参考文献： ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｕｎｍ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙ－ ｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２Ｏ０６，１０３（４２）：１５５４０ ［１］ Ｓａｋａｊｉｒｉ Ｓ，Ｋｕｍａｇａｉ Ｔ，Ｋａｗａｍａｔａ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎ— ［１１］ Ｒａｇｉｏｎｅ Ｆ，Ｃｒｉｎｉｔｉ Ｖ，Ｐｉｅｔｒａ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｓ ｍｏｄｕｌａｔｄｅ ｂｙ ｈｉｓｔｏｎｅ ｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｐ ｒｏｆｏｕｎｄｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃａｎｅ— ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｓａ ｎｅｗ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｂｕｔｙｒａｔｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ｅｒ ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ［Ｊ］．ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ，２００５，３３（１）：５３ ２００１，４９９（３）：１９９ ［２］ Ｈｉｓ Ｌ，Ｘｉ Ｘ，Ｌｏｔａｎ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｕｂ— ［１２］ Ｉｎｓｉｎｇａ Ａ，Ｍｏｎｅｓｔｉｏｒｌｉ Ｓ，Ｒｏｎｚｏｎｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐ ｔｏｓｉｓ ｖｉａ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅａｃｅｔｙｌｓａｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｔｕｍｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ １５一ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ一１ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔｌａ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ｔｈｅ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＮａｔＭｅｄ，２００５，１１（１）：７１ ２００４，６４（２３）：８７７８ （收稿日期：２００８－０３－３０；修回日期：２００８－０５２０） ［３］ Ｈｕ Ｅ，Ｄｕｌ Ｅ，Ｓｕｎｇ ＣＭ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｎｏｖｅｌ ｉｓｏｆｏｒｍ—ｓｅｌｅｃ— （本文编辑梁爱君） ｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｃｌａｓｓ １ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏ 文章编号：１００８－９９２６（２００８）０４－０３０７－０４ 中图分类号：Ｒ９１４．２ 文献标识码：Ａ 丹参中丹酚酸Ｂ纯化工艺研究 高声传①，张怀②，马宏达 （①沈阳军区总医院药剂科辽宁沈阳１１００１６；②沈阳药科大学药剂系辽宁沈阳１１００１６） 摘要：目的对丹参药材中丹酚酸Ｂ的提取工艺进行研究，比较两种大孔树脂的吸附能力和洗脱能力。方法 以丹酚酸Ｂ为考察 指标，用反相高效液相色谱法考察了丹参药材在６倍量水时的最佳提取时间以及丹参提取液在两种大孔树脂吸附工艺中的最大吸附 量和最佳洗脱条件。结果丹参水煮提取时间以４０ｍｉｎ时，丹酚酸Ｂ含量最大。ＡＢ一８型大孔树脂最大吸附量是１６．８ｍｇ－ｇ～，最佳洗 脱浓度是５０％的乙醇，最佳洗脱体积是４ＢＶ；１４００型树脂的最大吸附量是１７．２ｍｇ・ｇ～，最佳洗脱浓度是６０％的乙醇，最佳洗脱体积是 ５ＢＶ。结论利用大孔树脂精制丹参水溶性成分，在有效地保留丹酚酸Ｂ等有效成分的同时，可有效减少丹参提取物中非酚酸类及 杂质的含量，有利于提高制剂载药量。为丹参水溶性成分新制剂的工业化生产应用确定基础。 关键词：丹参；丹酚酸Ｂ；ＨＰＬＣ；大孔树脂 ①作者简介：高声传（１９６４一），男，山东淄博人，硕士，副主任药师。研究方向：缓释制剂。Ｔｅｌ：（０２４）２３８９７０７３；Ｅｍａｉｌ：ｇａｏｓｃ＠ｏｎｌｉｎｅ．ｉｎ．ｃｎ 维普资讯 http://www.cqvip.com ・３０８・ 解放军药学学报２００８年８月第２４卷第４期 Ⅱ Ｊ ＣｈｉｎＰＬＡ Ｖｏｌ ２４ Ｎｏ ８ Ａｕｇ ２００８ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｂ ｆｒｏｍ Ｓａｌｖｉａ Ｍｉｌｔｉｏｒｒｈ ａ Ｂｇｅ． ＧＡＯ Ｓｈｅｎｇ—Ｃｈｕａｎ①ＺＨＡＮＧ Ｈｕａｉ②ＭＡ Ｈｏｎｇ—Ｄａ ，，（①Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １ １００１６，Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｃｈｉｎａ） （②Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １ １００１６，Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ａｉｍ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ ｆｒｏｍ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｈｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｇｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｒｅｓｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ ｗａｓ ｄｅ－ ｔｅｒｍｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＨＰＬＣ ｔｏ ｆｉｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｉｎ ｗａｔｅｒ，ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｗｏ ｔｐｅｓ ｏｆ ｒｅｓｉｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｙｃ ａｃｉｄ Ｂ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｔ ｔｈｅ ｅｘ— ｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｆ ４０ ｍｉｎｕｔｅｓ；ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ（ＡＢ一８ ｔｐｅ）ｗａｓ １６．８ｍｇ・ｙｇ～； ｈｅ ｏｐｔｔｉｍｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｌｕｔｉｏｎ ｓｏｌｖｅｎｔ ｗａｓ ５０％ｅｔｈａｎｏｌ（ｖ／Ｖ），ａｎｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ ｗａｓ ４ＢＶ． ｈｅ ｍａｘｉＴｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ（１４００ ｔｐｅ）ｗａｓｙ １７．２ｍｇ・ｇ～；ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅ ｓｔｏｌｖｅｎｔ ｗａｓ ６０％ｅｔｈａｎｏｌ（ｖ／Ｖ）ａｎｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ ｗａｓ ５ＢＶ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｈｅ Ｔｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｈｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｇｅ ｃａｎ ｂｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒｃｏｐｈｙ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｆｅａｓｉｂｌｅ， ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｔｓ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｎｄ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｓａｌｖｉａ Ｍｉｈｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｇｅ；Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ；ＨＰＬＣ；Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ 丹参为唇形科植物丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｈｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｇｅ．）的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛，活血通经， 清心除烦等功效…。丹参是临床上常用的活血化 淤药，丹参制剂对冠心病、脑血栓、肝炎、肝硬化等有 显著疗效 。 近年的研究进一步表明，丹酚酸类在抗肝脏损 伤、抗动脉粥样硬化及细胞凋亡等方面也有着显著 活性 。本研究根据丹参研究的最新进展，提取制 为分析纯。 １．２仪器Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱系统（Ｗａｔｅｒｓ５０１ 泵，Ｗａｔｅｒｓ Ｍ４８６型紫外检测器，Ｗａｔｅｒｓ ＤＤＡ．Ｕ１３０一 ＢＮ真空泵）（均为Ｗａｔｅｒｓ公司），Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００Ａ Ｃ】８ 柱（迪马公司），ＫＱ３２００型超声波清洗仪（昆山市超 声仪器有限公司），ＡＵＷ１２０Ｄ型分析天平、ｕＶ一 ２５０１ ＰＣ型紫外扫描仪（均为岛津公司），ＴＣ一１５套式 恒温器（浙江新华医疗器械厂）。 ２方法与结果 备丹参水溶性精制物，针对肝脏损伤过程中发生的 脂质过氧化，抑制肝纤维化的形成。以丹参水溶性 成分中含量最高的活性物质丹酚酸Ｂ为指标，采用 反相高效液相色谱分析方法进行检测，考察丹参在 水提过程的最佳提取时间以及两种大孔吸附树脂对 ２．１色谱条件色谱柱：Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００Ａ Ｃ 柱（２５０ｍｍ ｘ４．６ｍｍ，５ ），流动相：乙腈－０．２％磷酸（２４：７６），柱 温：室温，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ，进样量：２０ 。 丹酚酸Ｂ的最大吸附量、最佳洗脱浓度和洗脱体积 等工艺条件，为药物质量标准的建立工业化生产应 用确定基础。 １仪器与试药 ２．２检测波长的选择将丹酚酸Ｂ对照品置于 Ｐ ０ 减压干燥器中干燥１２ｈ后，精密称取丹酚酸Ｂ 对照品１０．４２ｍｇ，置２５ｍｌ量瓶中，用适量甲醇超声 １０ｍｉｎ溶解，放置至室温，定容，摇匀，即得到浓度为 ４１６．８Ｉｘｇ・ｍｌ 的丹酚酸Ｂ对照品贮备液。取丹酚 酸Ｂ对照品贮备液用流动相适当稀释，摇匀，在２００ ～１．１试药丹参药材［沈阳军区总医院中药局提 供并由该局王江主管药师鉴定为唇形科植物丹参的 干燥根及根茎（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｈｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｇｅ．）］。丹酚酸 ４００ｎｍ范围内进行紫外扫描。由实验结果可知， 丹酚酸Ｂ在２８０ｎｍ处存在最大吸收，因此选择 ２８０ｎｍ作为检测波长。 ２．３专屙陛试验取粉碎后的丹参药材适量，置于锥 形瓶中，加入适量注射用水，超声提取２０ｍｉｎ，放置至室 Ｂ对照品（中国药品生物制品检定所）。ＡＢ一８型大 孔吸附树脂（南开大学化工厂），１４００型大孔吸附树 脂（扬州制药有限公司）。乙腈、甲醇为色谱纯。磷 酸（沈阳化学试剂厂）。水为注射用水。其他试剂 温，用注射用水适当稀释，作为样品。另取丹酚酸Ｂ对 维普资讯 http://www.cqvip.com 解放军药学学报２００８年８月第２４卷第４期Ｐｈａｒｍ Ｊ ２４ 照品贮备液适量，用注射用水适当稀释，作为对照品。 品贮备液１．０ｍｌ ２份，分别置１０ｍｌ量瓶中，水定容 各取２０ 进样测定。由实验结果可知，丹酚酸Ｂ的保 至刻度，得到浓度为４１．６８ｍｇ・ｍｌ 的对照品溶液。 留时间约为２０．５ｍｉｎ，峰形良好，理论塔板数为１３ ３００， （２）样品溶液的制备：将丹参药材粉碎，过２Ｏ目筛， 分离度＞１．５。在此液相色谱条件下，丹酚酸Ｂ与其他 精密称取丹参细粉２份，分别为０．０９９ ４、０．０９９ ５ｇ， 成分分离良好，对其测定无干扰。 置２个１００ｍｌ锥形瓶中，各加３０ｍｌ水，摇匀，冰浴超 ２．４线性关系考察分别精密量取丹酚酸Ｂ对照 声２０ｍｉｎ，分别滤过，用少量水冲洗锥形瓶和滤纸３ 品贮备液０．０５、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０ｍｌ，置１０ｍｌ量 次，将滤液及冲洗液一起转移到２个１００ｍｌ量瓶中， 瓶中，注射用水定容至刻度，各进样２０１ｚｌ，记录峰面 定容摇匀，微孔滤膜滤过，作为样品溶液。取对照品 积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回 溶液和样品溶液各２０１ｚｌ进样，测定丹酚酸Ｂ的峰面 归，得方程： 积，外标法计算样品溶液的含量。结果见表２。 Ａ＝４８ ７２０ Ｃ＋２２ ４３１．ｒ＝０．９９９ ９ 表２丹参中丹酚酸Ｂ含量测定结果 Ｔａｂ ２ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｅ ａｃｉｄ Ｂ 由实验结果可知，丹酚酸Ｂ浓度在２．０８４～ ８３．３６１ｚｇ・ｍｌ 范围内线性关系良好。 ２．５精密度试验取浓度为２０．８４１ｚｇ・ｍｌ 的丹酚 酸Ｂ对照品溶液，连续进样５次，每次２０１ｚｌ，测定其 ２００５年版药典规定丹参中丹酚酸Ｂ含量不低 精密度，ＲＳＤ为０．６２％，方法精密度良好。 于３％，实验用丹参符合要求。 ２．６稳定ｌ生试验取浓度为３３．３ｌａｇ・ｍｌ 的丹酚酸Ｂ ２．１０丹参水煮提取时间的考察取１００ｇ丹参药 样品溶液（批号：０６０５１９），避光保存，于室温下放置，每 材置１ ０００ｍｌ三颈瓶中，加水６００ｍｌ，浸泡１２ｈ后开 隔２ｈ进样２０ ，ＲＳＤ为０．６８％（１１，＝５）。说明丹酚酸 始加热回流。以大火加热，待接近沸腾时改为小火， Ｂ对照品溶液在避光条件下，８ｈ内稳定。 并保持微沸状态，沸腾开始计时，分别在０、３０、４０、 ２．７加样回收率试验精密称取已知含量的同一 ５Ｏ、６Ｏ、８０、１００ｍｉｎ时取３ｍｌ，用微孔滤膜滤过，弃去 样品５份（批号：０６０５１９），分别精密加入一定量的 初滤液１．５ｍｌ，收集续滤液，取续滤液１ｍｌ置５０ｍｌ 丹酚酸Ｂ对照品，按２．２制备方法制备样品溶液，取 量瓶中，加水定容，取２０１ｚｌ测定，外标一点法计算样 ２０１ｚｌ进样。根据峰面积，计算含量，结果见表１。 品中丹酚酸Ｂ的浓度，测出系统中丹酚酸Ｂ的含 表１加样回收率测定结果（ｎ＝６） 量。结果丹参在６倍量水中，以微沸状态加热 Ｔａｂ １ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓａｌｖｉａｎｏｌｌｃ ａｃｉｄ Ｂ（ｎ＝６） ４０ｍｉｎ时含量最高。 样品量 加人量 测得量 回收率 ； ＲＳＤ （１ａ，ｇ） （Ｉｘｇ） （１ａ，ｇ） （％） （％） （％） 在以后的提取操作中，为了使药材中的丹酚酸 ３３．３ ４１．６８ ７５．１２ ｌＤＤ．３３ Ｂ更完全提取出来，同时减少丹酚酸Ｂ含量的降低， ３３．３ ４１．６８ ７４．８１ ９９．５９ 采用动态热回流提取，第１次用６倍量提取４０ｍｉｎ ３３．３ ４１．６８ ７５．６２ １０１．５３ １０１．０９ １．６３ ３３．３ ４１．６８ ７６．０１ １０２．４７ 后，用３倍量提取２次，每次３０ｒａｉｎ，合并提取液，滤 ３３．３ ４１．６８ ７６．５７ １０３．３８ 过，定容，并测定溶液中丹酚酸Ｂ的含量，计算提取 ３３．３ ４１．６８ ７４．６６ ９９．２３ 率，从丹参药材中提取出３．２％的丹酚酸Ｂ。 ２．８定量限试验精密量取浓度为２．０８４ｌａｇ・ｍｌ 的 丹酚酸Ｂ对照品溶液１．０ｍｌ，置于５０Ⅱｄ量瓶中，用注射 ３大孔吸附树脂性能的考察 用水定容至刻度，摇匀，得到浓度为４１．６８ｎｇ・ｍｌ 的溶 在本研究中选用了两种大孔吸附树脂，分别进 液。进样２０ 。由色谱图显示，主药峰约为噪音宽的 行如下考察。 １Ｏ倍，故以此浓度作为丹酚酸Ｂ的定量限。 ３．１ 最大吸附量大孔树脂对丹酚酸Ｂ动态吸附 ２．９丹参中丹酚酸Ｂ含量测定文献 报道丹酚酸 随着提取液的加入，丹酚酸Ｂ的未吸附率会越来越 Ｂ具有热不稳定性，针对该特性本研究采用粉碎后冰 大，但大孔树脂吸附具有饱和性＿５ Ｊ。本实验就是将 浴超声。在溶剂的选择方面，有文献报道＿５ 超声提取 足量的已知丹酚酸Ｂ含量的丹参水提液通过大孔 以７Ｏ％甲醇提取率最高，水的提取率相对较低，但水成 树脂，测出流出液中丹酚酸Ｂ的含量，算出丹酚酸Ｂ 本低，又不会造成污染，提取后无有机溶剂残留，后处 的减少量，即为树脂的最大吸附量，为了进一步验证 理方便。所以本研究采用水作为溶剂提取。 大孔树脂是否吸附完全，在通过液中多加入已知丹 （１）对照溶液的配制：精密量取丹酚酸Ｂ对照 酚酸Ｂ含量的丹参水提液，若树脂吸附饱和，那么 维普资讯 http://www.cqvip.com ・３１０・ 解放军药学学报２００８年８月第２４卷第４期Ｐｈａｒｍ Ｊ ＣｈｉｎＰＬＡ Ｖｏｌ ２４ Ｎｏ ８ Ａｕｇ ２００８ 这部分丹酚酸Ｂ就不会被吸附。 取１０ｇ ＡＢ－８型干树脂２份，装入两根内径为 定５ＢＶ为最佳洗脱体积。 １３ｍｍ的玻璃柱，编为１、２号柱，分别取２００、２２０ｍｌ 已知丹酚酸Ｂ浓度的丹参水提取液，以１ｍｌ／ｍｉｎ的 流速分别通过１、２号柱，再用ｌＯＯｍｌ注射用水以 ｌｍｌ／ｍｉｎ通过１、２号柱，收集流出液，定容至５０Ｏｒａｌ， 孽 ＊ 龋 端 稀释１０倍，微孔滤膜滤过，分别测定丹酚酸Ｂ的含 量，算出丹酚酸Ｂ的减少量。结果表明通过两根柱 图１不同洗脱浓度的洗脱率比较图２不同洗脱体积的洗脱率比较 Ｆｉ窖１ Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｌｕｔｌｎｇ Ｆｉｇ ２ Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｕｒｉｎｇ 子丹酚酸Ｂ的减少量相同。其最大吸附量为１６．８ ｍｇ・ｇ～。用同法测出１４００型大孔树脂的最大吸附 量为１７．２ｍｇ・ｇ～。可以看出两种大孔吸附树脂对 丹酚酸Ｂ的最大吸附量相近。 ３．２最佳洗脱浓度取６份重量为１０ｇ的ＡＢ－８型 干树脂，预处理完成后，装入同样规格的玻璃柱，分 别用２００ｍｌ丹参水提取液通过大孔树脂，吸附饱和 后，用１００ｍｌ水冲出树脂中未吸附的丹酚酸Ｂ，分别 用２ＢＶ的１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％的乙醇 洗脱树脂，收集洗脱液，减压浓缩后，将剩余溶液转 移至５０ｍｌ量瓶中，加水定容，微孔滤膜滤过，精密移 取ｌｍｌ置５０ｍｌ量瓶中，用水稀释并定容，用ＨＰＬＣ 外标一点法测定各浓度洗脱液中丹酚酸Ｂ的含量， 算出丹酚酸Ｂ的洗脱率，结果最佳洗脱浓度为 ５０％。取４份重量为１０ｇ的１４００型干树脂同上述 方法操作，分别用２ＢＶ的２０％、４０％、６０％、８０％的 乙醇洗脱树脂，收集洗脱液，旋转蒸流除去乙醇后， 用水溶解，并定容至５０ｍｌ，微孔滤膜滤过，取ｌｍｌ置 ５０ｍｌ量瓶中，加水定容，用ＨＰＬＣ外标法测定各浓 度洗脱液中丹酚酸Ｂ的含量，得到丹酚酸Ｂ的洗脱 率，最佳洗脱浓度为６０％，结果见图１。 ３．３最佳洗脱体积样品的洗脱体积越大，洗脱的 量越多，但在实验中，当洗脱下来大孔树脂对丹酚酸 Ｂ的吸附量为９５％以上时，每增加１ＢＶ的洗脱液， 洗脱下来的丹酚酸Ｂ量很少，所以本实验选用能洗 脱下来丹酚酸Ｂ吸附量９５％的最少保留体积为最 佳洗脱量。分别称取上述两种干大孔树脂ｌＯｇ，预 处理完成后，装入内径为１３ｒａｍ的玻璃柱，用２００ｍｌ 丹参水提液通过大孔树脂，吸附饱和后，用ｌＯＯｍｌ水 冲出树脂中未吸附的丹酚酸Ｂ，ＡＢ－８型用５０％的乙 醇，１４００型用６０％的乙醇溶液冲洗大孔树脂，分别 收集２、３、４、５、６ＢＶ时的流出液，用ＨＰＬＣ法测其含 量，计算洗脱率。结果见图２。ＡＢ－８型大孔树脂当 洗脱体积为４ＢＶ时，９７％的丹酚酸Ｂ被洗脱下来， 确定４ＢＶ为最佳洗脱体积。１４００型大孔树脂当洗 脱体积为５ＢＶ时，有９６％的丹酚酸Ｂ洗脱下来，确 ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆｔｗｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｒｅｓｉｎ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆｔｗｏｔｙｐｅｓ ｏｆｒｅｓｉｎ ４讨论 ４．１ 由于丹酚酸Ｂ属于酚酸类物质，在ＨＰＬＣ色谱 中容易产生峰脱尾现象，在流动相中加了０．２％的 磷酸，调节ｐＨ值，以减小丹酚酸Ｂ的解离，使丹酚 酸Ｂ的脱尾峰得到良好的改善，拖尾因子可以控制 在１．１以下。 ４．２本研究中，曾采用甲醇．水洗脱系统作为流动 相，但分离效果不理想，丹酚酸Ｂ峰形较差，故改用 乙腈一水作为流动相，得到了良好的分离效果。 ４．３丹酚总酸为水溶性物质，在本研究中采用传统 的水煮提取方法。如果用醇提取，将会把丹参中的 部分酯溶性物质提取出来，增加水不溶性杂质，给后 续加工增加困难。 ４．４文献报道乙醇体系有利于丹酚酸Ｂ的稳定。 在工艺中将丹参水提液过大孔吸附树脂，以乙醇洗 脱富集丹酚酸，使其存在体系由水相改变为乙醇相， 既可降低减压浓缩温度，又利用丹酚酸在乙醇体系 中较为稳定的性质，减少丹酚酸在提取工艺过程中 的损失，保证提取物具有较高的疗效，降低制剂的载 药量。 参考文献： ［１］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［Ｓ］．北京：化 学工业出版社，２００５．５２ ［２］ 李朝霞，王地．丹参水溶性成分的研究进展［Ｊ］．北京中医， ２００４，２３（３）：１７６ ［３］ 中国医学科学院药物研究所．中草药现代研究［Ｍ］．北京医科 大学中国协和医科大学联合出版社，１９９６．４７２ ［４］ 张军，王风云，詹丽玲，等．丹参药材提取液中丹酚酸Ｂ稳定 性影响因素的考察［Ｊ］．中国中药杂志，２００５，３０（１０）：７８９ ［５］王凤霞，李磊，柳先平，等．丹参药材中丹酚酸Ｂ的提取及其 ＨＰＬＣ法测定［Ｊ］．现代中药研究与实践，２００４，１８（增刊）：６２ ［６］ 张军，王风云，肖凤霞，等．丹参药材提取液中丹参酚酸大孔树脂 吸附工艺研究［Ｊ］．中国新药与临床药理，２００５，１６（３）：２０６ （收稿日期：２００７－０８－０２；修回日期：２００８－０２－０５） （本文编辑梁爱君）
