２０１０正 ｌ２月 首都医科大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｄｅｃ．２０１０ 第３１卷 第６期 Ｖ０１．３１ Ｎｏ．６ ［ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６－７７９５．２０１０．０６．００１］ ・ＨＩＶ／ＡＩＤＳ基础与临床研究进展・ １型ＨＩＶ感染多重ＰＣＲ检测方法的建立及临床应用 代丽丽 陈德喜 石 英 魏飞力 刘志英 张洪海 吴亚松 梁连春 吴 昊 张彤 （首都医科大学附属北京佑安医院感染中心） 【摘要】 目的建立检测人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ．１）的多重巢式ＰＣＲ（ｎＰＣＲ）和多重反转录ＰＣＲ（ＲＴ—ＰＣＲ）方法。将其与已 经上市的ＮＡＳＢＡ法试剂盒进行检测敏感性比较；探讨血浆ＲＮＡ水平对ＰＣＲ检测敏感性的影响；评价该方法用于我国ＨＩＶ一１感 染者诊断的价值。方法针对ＨＩＶ一１的ｇａｇ、ｐｏｌ和ｇｏ４１区设计３套引物，建立检测ＨＩＶ ＤＮＡ的多重ｎＰＣＲ和检测ＨＩＶ ＲＮＡ的 多重ＲＴ—ＰＣＲ方法；分别以建立的ＰＣＲ方法和ＮＡＳＢＡ法对１１９例ＨＩＶ阳性患者进行检测，比较２者的检测敏感性；将患者分为 不同的病毒载量组，比较ＰＣＲ方法在各组患者中的检测敏感性差异；使用建立的ＰＣＲ方法对ｌ０例可疑急性感染者进行检测；扩 增ＨＩＶ．１膜区ｃ２．ｃ３段，对ｎＰＣＲ检测阳性的４３例ＤＮＡ样本进行亚型鉴定。结果多重ｎＰＣＲ的检测敏感度为９７．５％（１１６／ １１９），多重ＲＴ．ＰＣＲ的敏感度为７８．２％（９３／１１９），２者的特异度均为１００％（５０／５０），多重ｎＰＣＲ和多重ＲＴ—ＰＣＲ的阳性预测值分 别为９７．５％（１１６／１１９）和７８．２％（９３／１１９），阴性预测值均为１００％（５０／５０），准确性分别为９８．２％和８４．６％。经比较，多重 ｎＰＣＲ和多重ＲＴ．ＰＣＲ的检测敏感度都高于ＮＡＳＢＡ法。在病毒载量＜１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ的患者，ｎＰＣＲ的检测敏感性高于ＲＴ—ＰＣＲ，在 病毒载量在（１０ ～ｌ０ ）ｃｏｐｙ／ｍＬ的患者及病毒载量≥１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ的患者，２者的敏感性比较相近，均接近１００％；检测的ｌＯ例可 疑急性感染者中，有５例患者的ｎＰＣＲ和ＲＴ．ＰＣＲ检测结果阳性，抗体在随访过程中阳转，证实为ＨＩＶ急性感染者；检测的４３例 ＤＮＡ样本分属于Ｂ’亚型（３７例），ＡＥ亚型（５例）和ＢＣ亚型（１例）。结论本课题组建立的ＰＣＲ检测方法可以对我国主要流 行的Ｂ’、ＡＥ和Ｂｃ亚型病毒株得到很好的扩增效果；ｎＰＣＲ的检测敏感性受血浆ＲＮＡ水平的影响相对较小，ＲＴ—ＰＣＲ的检测敏感 性受血浆ＲＮＡ水平的影响相对较大；ＰＣＲ方法可以用于ＨＩＶ急性感染者的早期诊断。 【关键词】人类免疫缺陷病毒；核酸检测；聚合酶链式反应；诊断 【中图分类号】Ｒ４６６．６ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ－１ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＤＡＩ Ｌｉ—ｌｉ，ＣＨＥＮ Ｄｅ—ｘｉ，ＳＨＩ ｒｉｎｇ，ＷＥＩ Ｆｅｉ—ｌｉ，ＬＩＵ Ｚｈｉ—ｙｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｈａｉ，ＷＵ Ｙａ－ｓｏｎｇ，ＬＩＡＮＧ Ｌｉａｎ・ ｃｈｕｎ，ＷＵ Ｈａｏ，ＺＨＡＮＧ Ｔｏｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｏｕａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， 【ＡＢｓＴＲＡｃＴ】 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎｅｓｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ｎＰＣＲ）ａｎｄ ＲＴ—ＰｃＲ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ．１（ＨＩＶ．１）ａｎｄ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ａ ｍａｒｋｅｔｅｄ ａｓｓａｙ．ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）．Ｍｅｔｈｏｔｉｓ Ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎ ｎＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｆ０ｒ ＨⅣＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｓｅｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｈｉｃｈ ｔｒａｇｅｔ ｇａｇ，ｐｏｌ ａｎｄ ｇｐ４ｌ ｄｉｓｔｉｒｃｔｓ ｉｎ ＨＩＶ－１ ｇｅｎｅ．Ａ ｔｏｔｌ ｏｆ ｌ ａｌ９ ＨＩＶ ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ＮＡＳＢＡ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ．ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｖ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｅｎ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ａｃｕｔｅ ｉｎｆｅｅｔｉｏｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔＩｌｅ ｅｓｔｂｌａｉｓｈｅｄ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ Ｃ２．Ｃ３ ｄｉｓｔｉｃｔｒ ｉｎ ＨＩＶ．１ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｉｎ ４３ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅｉｒ ｓｕｂｔｙｐｅ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎＰＣＲ ｗａｓ ９７．５％（１１６／１１９）．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＴ．ＰＣＲ ｗａｓ ７８．２％（９３／１１９）．Ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｅｒｅ ｌ０ｏ％（５Ｏ／５０）．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ９７．５％（１１６／１１９）ａｎｄ ７８．２％（９３／１１９）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｗｅｒｅ １０ｏ％（５０／５Ｏ）．Ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ９８．２％ａｎｄ ８４．６％．Ｔｈｅ ｎＰＣＲ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｎ ＮＡＳＢＡ（９７．５％琊７３．１％）．１１１ｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎＰＣＲ ｗａｓ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＲＴ．ＰＣＴ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ＜１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ．ｂｕｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｎＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ—ＰＣＴ ｗｅｒｅ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ（ｎｅａｒｌｙ １００％）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ １０ 一１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ ａｎｄ≥１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ．Ｆｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ １０ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ａｃｕｔｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙ ｔｈｅ ＰＣＲ．ａｎｄ ｈａｄ ａ ｓｅｍｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｆｔｅｒｗａｒｄｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗ ｕｐ．ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｏ ｈａｖｅ ａｃｕｔｅ ＨＩＶ ｉｎｆｅｅｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ４３ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ 基金项目：国家重点基础研究发展计划（２００６ＣＢ５０４２０１），北京市科委科技计划重大项目（Ｄ０９０６００３０４０５９１），Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（２００６ＣＢ５１Ｍ２０１）ａｎｄ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（Ｄ０９０６００３０４０５９１） ￥Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｔｄｏｃ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ ６８８ 首都医科大学学报 第３ｌ卷 ｂｅｌｏｎｇ ｔｏ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｂ’（３７ｃａｓｅｓ），ＡＥ ｓｕｂｔｙｐｅ（５ ｃａｓｅｓ）ａｎｄ ＢＣ ｓｕｂｔｙｐｅ（１ ｃａｓｅ）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ ｓｕｂｔｙｐｅｓ Ｂ’，ＡＥ ａｎｄ ＢＣ，ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｎ ＮＡＳＢＡ．Ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｈａｓ ｓｍａｌｌｅｒ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎＰＣＲ ｔｈａｎ ｏｎ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ ＨＩＶ ＰＣＲ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙ Ｃａｌｌ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ ａｃｕｔｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． 【ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ】ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）；ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔｅｓｔ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）；ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｓｓａｙ 聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）方 来自于河南省有偿献血人群），性途径感染者７７例 法具有敏感、特异、简便、经济的特点，很早就有人尝 （占总数的５１．３％，包括北京地区同性恋感染者６７例 试将ＰＣＲ技术应用于ＨＩＶ感染的诊断，并取得了良 及各地散发异性性途径感染者ｌ０例），静脉吸毒感染 好的效果¨ 。但是，由于ＨＩＶ的高变异性，单套引 者１例（０．７％，来自于地区）；其中３４例患者正 物系统很难获得理想的检测敏感度和特异度 ，而 在接受抗病毒治疗（２２．４％）。 多套引物联合检测的ＰＣＲ方法，由于各系统的反应 ２）阴性对照５０例：根据目前的ＨＩＶ感染实验室 条件和参数不同，操作相对复杂 ｊ。本研究根据我国 排除标准，选取２００６年６月间于首都医科大学附属 ＨＩＶ流行特点，针对ＨＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌ、ｇｐ４ｌ区设计了能覆 北京佑安医院门诊就诊的２次ＨＩＶ抗体初筛试验阴 盖我国主要ＨＩＶ流行株的３套引物，建立检测病毒核 性者５０例（年龄ｌ９～５５岁）作为阴性对照，其中包括 酸ＲＮＡ、前病毒ＤＮＡ的多重巢式ｎＰＣＲ和多重ＲＴ— ＨＢＶ感染者ｌ０例，ＨＣＶ感染者ｌ０例。 ＰＣＲ检测方法，在保证了检测敏感性的基础上大大的 ３）可疑急性感染者１０例：无明确的ＨＩＶ感染史。 （ＮＡＳＢＡ法），２例患者的病毒载量阳性，ＷＢ结果可疑。 １．２主要试剂和仪器 简化了操作程序，减少了检测成本和污染的机会，并 其中８例患者的抗体检测结果阴性而病毒载量结果阳性 对其进行临床应用研究。 １材料和方法 １．１标本组成 ＤＮＡ、ＲＮＡ提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于德 国Ｑｉａｇｅｎ公司，Ｔａｇ酶、Ｔａｋａｒａ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ １）ＨＩＶ阳性患者１５０人：选取２００６年５月～ （ＡＭＶ）试剂购自大连宝生物工程有限公司，以法国 ｏＭｅｒｉｒｕｘ公司的ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ ＨＩＶ－１ ＱＴ试剂盒进行 ２００７年９月间在首都医科大学附属北京佑安医院门 Ｂｉ诊及住院的ＨＩＶ阳性患者１５０例。根据目前的ＨＩＶ ＮＡＳＢＡ法病毒载量检测（临界值为２５ ｃｏｐｙ／ｍＬ，线性 感染实验室诊断标准，所有患者的ＨＩＶ抗体初筛 检测范围５１～５ ３９０ ０００ ｃｏｐｙ／ｍＬ），ＰＣＲ仪型号为 （ＥＨＳＡ法，Ｖｉｒｐｓｔｉｋａ ＨＩＶ ＵｎｉｆｏｒｉＢ Ｉ１ ｐｌｕｓＯ，Ｏｒｇａｎｏｎ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００。 Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；ＨＩＶ１＋２抗体诊断试剂盒，北京 １．３建立ＨＩＶ－１ ＰＣＲ检测方法 金豪制药有限公司）及确认试验［免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ １）引物的设计和选择：分别针对ＨＩＶ－１的ｇａｇ、 ｂｌｏｔｔｉｎｇ），ＨＩＶ ｂｌｏｔ ２．２，新加坡Ｇｅｎｅｌａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｐｏｌ和ｇｏ４１区设计３套引物，建立检测ＨＩＶ ＤＮＡ的巢 公司，中国ＣＤＣ］阳性。其中，男８５例，女６５例，年龄 式ＰＣＲ（ｎＰＣＲ）和检测ＨＩＶ ＲＮＡ的反转录ＰＣＲ（ＲＴ— ｌ３ ５９岁；输血感染者７２例（占总数的４８．Ｏ％，主要ＰＣＲ）方法。各引物序列见表１。 表１用于ＰＣＲ扩增的三套引物 Ｔａｂ．１ Ｔｈｌｒｅｅ ｓｅｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＰＣＲｓ Ｒ＝Ａ ０１ｅ Ｇ：ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ｝ｍａｇｋｅｒｉｓ ｏｗ／ｌ ｄｅｓｉｇｎｅｄ 第６期 代丽丽等：１型ＨＩＶ感染多重ＰＣＲ检测方法的建立及临床应用 ６８９ ２）标本准备：取静脉血５ ｍＬ乙二胺四乙酸（ＥＤ— 条件。 ＴＡ）抗凝，４ ｈ内离心，留取浓集白细胞层和血浆，按 照操作说明书提取ＤＮＡ和病毒ＲＮＡ，分装后冻存。 ７）建立多重ｎＰＣＲ和多重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法：在 已经建立的ｎＰＣＲ和ＲＴ．ＰＣＲ反应体系中同时加入３ ３）建立检测前病毒ＤＮＡ的ｎＰＣＲ方法：第１轮 套系统的上、下游引物，并减少相应量的无菌去离子 ｘＬ；去掉ｐｏｌ系统的内侧上 ＰＣＲ体系：１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ ｔｔＬ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１，２．０ 水，使反应终体积仍为２５ ｉＬ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２．０ ｔｚＬ，５ Ｕ／ｉｘｌ Ｔａｇ酶０．１２５ 游引物ＲＡＲ１０３２，将其改为半ｎＰＣＲ，扩增片段变为 Ｌ，２０ ｍｍｏｌ／Ｌ上、下游引物各０．５ ＩｘＬ，模板（ＤＮＡ提 ２７４ ｂｐ，反应条件不变；根据扩增效果适当调整３套引 取液）５ Ｌ，以无菌去离子水将反应终体积调整到 物的浓度。产物检测方法同前，如果出现１５４ ｂｐ ２５ Ｌ。第１轮反应条件：９４ ｏＣ ５ ｍｉｎ，５５℃１ ｒａｉｎ， ７２ ｃＩ＝２ ｍｉｎ（预循环），９４ ｏＣ ３０ ｓ，５５ ｏＣ ３０ ｓ，７２ ｏＣ １ ｍｉｎ（３０个循环），７２ ｃ《＝１０ ｒａｉｎ。第２轮ＰＣＲ体系：将 第１轮反应产物１ ＩｘＬ作为模板，同样以无菌去离子 水将反应终体积调整到２５ ，其余反应参数不变。 第２轮ＰＣＲ条件：９４ ｃＩ＝２ ｒａｉｎ，５５℃５０ Ｓ，７２ ｏＣ ９０ Ｓ （预循环），９４ ３０ Ｓ，５５℃３０ Ｓ，７２ ｏＣ １ ｍｉｎ（３０个循 环），７２℃１０ ｍｉｎ。每次检测同时设置阴、阳性对照 及空白对照。 ４）建立检测血浆ＨＩＶ ＲＮＡ的反转录ＰＣＲ（ＲＴ— ＰＣＲ）方法：反转录反应体系和反应条件参照ＴａＫａＲａ 一步法反转录试剂盒说明书：１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ ｔｔＬ，２５ ｍｍｏ￣Ｌ ＭｇＣｌ２ ５ Ｌ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２．５ ｔｘＬ，５ Ｕ／ Ｌ Ｔａｇ酶０．５ Ｌ，２０ ｍｍｏｌＺＬ上游引物０．５ Ｌ，２０ ｍｍｏｌ／／ Ｌ下游引物０．５ ｉｘＬ，ＲＮＡ提取液１０ Ｌ，４０ Ｕ／ Ｌ ＲＮＡ酶抑制剂０．５ ｔｒＬ，５ Ｕ／ Ｌ ＡＭＶ反转录酶０．５ Ｌ，以无菌去离子水将反应调整到２５ Ｌ终体积。反 应条件：５０ ｏＣ ３０ ｍｉｎ，９４℃２ ｍｉｎ（预变性），９４ ｏＣ ３０ Ｓ，５５ ｏＣ ３０ Ｓ，７２ ｏＣ ９０ Ｓ（３５个循环），７２℃１０ ｍｉｎ。反 转录后的ｎＰＣＲ体系、反应条件同前面建立的ｎＰＣＲ 方法的第２轮反应。每次检测同时设置阴、阳性对照 及空白对照。 ５）产物检测及结果判读：取第２轮ＰＣＲ反应产 物９ ＩｘＬ加１ ＩｘＬ １０×ｂｕｆｆｅｒ，以３％琼脂糖凝胶、１２０ Ｖ 电泳１５ ｒａｉｎ后，紫外透射成像仪下观察结果。在阴阳 性对照结果正常的情况下，与ＤＮＡ标准带相比，出现 相应大小的扩增片段判为阳性，否则为阴性。ｇａｇ、 ｐｏｌ、ｇｐ４１共３个系统的目的片段大小分别是１５４、１７０ 和４０２ ｂｐ。 ６）反应参数的优化：以ＨＩＶ阳性的标本分别在 Ｍｇ”浓度０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５ ｍｍｏ￣Ｌ 和５０℃、５５℃、６０ ３个退火温度下进行ＰＣＲ扩增， 确定各系统的最佳反应条件。在此基础上，选择３套 引物系统都能得到较好扩增的条件作为共同的反应 （ｇａｇ）、２７４ ｂｐ（ｐｏ１）或４０２ ｂｐ（ｇｐ４１）大小的扩增片段 中的任意一个即判为阳性，３个片段全部阴性即判为 阴性。 １．４建立的多重ＰＣＲ方法的临床应用研究 １）与金标准方法的比较：分别以建立的多重 ｎＰＣＲ和ＲＴ．ＰＣＲ方法对１５０例阳性患者及５０例阴性 患者进行检测，以ＥＬＩＳＡ／Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ相结合的抗 体检测结果为金标准，计算所建立的多重ＰＣＲ方法 的检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准 确性。 ２）与ＮＡＳＢＡ法试剂盒进行检测敏感性比较：在 上述１５０例ＨＩＶ阳性患者中有１１９例患者自愿进行 了病毒载量检测（ＮＡＳＢＡ法试剂盒），其中包括了３４ 例正在接受抗病毒治疗的患者。如果ＮＡＳＢＡ的检测 结果为＜最低检测下限（１ｏｗｅｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ，ＬＤＬ） 判为阴性，否则判为阳性，计算该方法的检测敏感性。 同时以建立的多重ｎＰＣＲ和多重ＲＴ—ＰＣＲ方法对 ＮＡＳＢＡ法检测的同份血标本进行检测，计算各自的 检测敏感性，并分别与ＮＡＳＢＡ法的检测敏感性进行 比较。 ３）比较２种多重ＰＣＲ检测方法在不同病毒载量 患者中的检测敏感性：依据ＮＡＳＢＡ检测结果，将１１９ 例患者分为病毒载量阴性组和病毒载量阳性组，比较 ｎＰＣＲ和ＲＴ—ＰＣＲ方法在２组患者中的检测敏感性是 否存在差异；并进一步将患者分为＜ＬＤＬ、＜ｌｏｇ３（包 含＜ＬＤＬ组的样本）、ｌｏｇ３一ｌ０ｇ４和＞ｌｏｇ４病毒载量由 低到高的４个组，平行比较多重ｎＰＣＲ和ＲＴ ＰＣＲ ２ 种方法在各组患者间的敏感性差异。 ４）ＰＣＲ检测准确性判断：以建立的多重ｎＰＣＲ与 ＲＴ－ＰＣＲ方法对ｌ０例可疑急性感染者进行检测，随访 其抗体检测的结果，判断ＰＣＲ检测的准确性。 ５）对部分ＰＣＲ阳性样本进行亚型鉴定：按照标 本编号顺序采取隔２选１的方法选择检测阳性的 ＤＮＡ标本５Ｏ份，以ＨＩＶ一１ｅｎｖ区ｃ２．Ｃ３段特异引物 第３１卷 ９＋５０）］。检测结果见表 （ＥＤ５／ＥＤＩ２，ＥＤ３１／ＥＤ３３）进行ｎＰＣＲ扩增。最终有 和８４．６％［（９３＋５０）／（１ｌ３，多重ｎＰＣＲ和多重ＲＴ—ＰＣＲ的扩增电泳图见图ｌ。 ４３份样本扩增出目标片段（其中包括河南有偿输血 ２、感染者３２份，北京同性恋感染者１１份）。扩增产物 经回收、纯化后测序，通过Ｂｉｏｅｄｉｔ、Ｍｅｇａ软件与标准 表２多重ｎＰＣＲ与ＥＬＩＳＡ／Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ相结合 的抗体检测方法（血清学方法）比较 Ｔａｂ．２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｉｔｐｌｅ ｎＰＣＲ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ／ 亚型序列进行比对，计算基因离散率，构建系统化树， 确定标本序列的亚型。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ ｔ（ｃａｓｅ） ２ 结果 ２．１多重ｎＰＣＲ和多重ＲＴ－ＰＣＲ检测结果 以ＥＬＩＳＡ／Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ相结合的抗体检测结 果（血清学方法）为金标准，多重ｎＰＣＲ的检测敏感度 为９７．５％（１ １６／１１９），多重ＲＴ—ＰＣＲ的敏感度为 ７８．２％（９３／１１９）。２种方法对５０份阴性标本的检测 结果全部为阴性，特异度１００％（５０／５０）。多重ｎＰＣＲ 表３ 多重ＲＴ．ＰＣＲ与ＥＬＩＳＡ／Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ相结合 的抗体检测方法（血清学方法）比较 Ｔａｂ．３ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ／Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ （ｃａｓｅ） 和多重ＲＴ．ＰＣＲ的阳性预测值分别为９７．５％（１ １６／ １１９）和７８．２％（９３／１１９），阴性预测值均为１００％（５０／ ５０），准确性分别为９８．２％［（１１６＋５０）／（１ｌ９＋５０）］ Ｍ １ ２ ３ ４ ５００ｂｐ ２５０ ｂｐ ５００ ｂｐ ２５０ｂｐ １００ ｂｐ １００ｂｐ Ｂ 图１ 多重ｎＰＣＲ扩增电泳图与多重ＲＴ－ＰＣＲ扩增电泳图 Ｆｉｇ．１ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｍｕｌｉｐｌｔｅ ｎＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ・ＰＣＲ Ａ：ｔｈｅ ａｍｐｌｉｉｃａｔｆｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎＰＣＲ；Ｂ：ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＲＴ－ＰＣＲ；Ｍ：ｍａｒｋｅｒ １：ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃａｓｅ（ｙｍ－１９）；２：ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；３：ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；４：ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏ１． ２．２ 与ＮＡＳＢＡ法试剂盒的检测敏感度比较 载量的增高而增高，但是在低病毒载量组（＜ＬＤＬ组 以ＥＬＩＳＡ／Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔｔｉｎｇ相结合的抗体检测方 和＜ｌｏｇ３组），ｎＰＣＲ的检测敏感性要高于ＲＴ．ＰＣＲ。 法（血清学方法）为金标准，ＮＡＳＢＡ法对１１９例阳性 在病毒载量高于１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ的患者，两者的检测敏 患者的检测敏感度为７３．１％（８７／１１９），多重ｎＰＣＲ的 感性则十分接近。 检测敏感度为９７．５％（１１６／１１９），多重ＲＴ－ＰＣＲ的检 ２．４ １０例可疑急性感染者检测结果 测敏感度为７８．２％（９３／１１９）。 ｌＯ例可疑急性感染者中，有５例患者的ｎＰＣＲ和 ２．３ ｎＰＣＲ与ＲＴ－ＰＣＲ方法之间的检测敏感性比较 ＲＴ—ＰＣＲ检测结果阳性，抗体在随访过程中阳转，证实 在平行检测的１１９名阳性患者中，ｎＰＣＲ和ＲＴ． 为ＨＩＶ急性感染者；另外５例患者的ＰＣＲ检测阴性， ＰＣＲ的检测敏感性分别为９７．５％（１１６／１１９）和 抗体随访半年为阴性，除外了ＨＩＶ感染。除外感染的 ７８．２％（９３／１１９）。进一步分组比较可以看出，两者的 ５例患者的ＮＡＳＢＡ法病毒载量检测值均＜１０ ｃｏｐｙ／ 差异主要表现在对低病毒载量患者的检测能力不同 ｍＬ（表５）。 （表４）。ｎＰＣＲ和ＲＴ—ＰＣＲ的检测敏感性都随着病毒 第６期 代丽丽等：１型ＨＩＶ感染多重ＰＣＲ检测方法的建立及临床应用 表４ ｎＰＣＲ和ＲＴ．ＰＣＲ在不同病毒载量患者的 检测敏感性比较 Ｔａｂ．４ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｉｎ ｃａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ２．５ ４３例阳性样本的亚型鉴定结果 来自于河南省有偿献血人群的３２个毒株均为泰 国Ｂ亚型，与国际标准株间的基因离散率为（８．４± ０．７）％；而来自于北京同性恋人群的１１份标本则分属 于泰国Ｂ亚型（５份）、ＡＥ亚型（５份）和ＢＣ亚型（１ 份）。其与各国际标准株问的基因离散率分别为１６％、 ６．８％和７．４％。所形成的系统进化树见图２，３。 ３讨论 ＬＤＬ：ｌｏｗｅｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ＨＩＶ感染及其所引起的艾滋病是高度依赖实验 表５ １０例可疑急性感染者ＰＣＲ检测结果及抗体随访结果 Ｔａｂ．５ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ １０ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ “一”：Ｎｅｇａｔｉｖｅ；“＋”：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；“±”：Ｓｕｓｐｉｃｉｏｕｓ；“＼”：Ｍｉｓｓｉｎｇ；‘‘Ｙ”：ｙｅｓ；“Ｎ”：ｎｏｔ 丽 图２ ３２例河南省有偿献血感染者体内ＨＩＶ一１毒株的系统进化树 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ３２ ｂｌｏｏｄ ｄｏｎｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｈｅｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ 首都医科大学学报 第３１卷 ｈｏｍｏ４ ｈｏｍｏｌＯ ｈｏｍｏ９ ｈｏｍｏ７ Ｂ．ＴＨ．９０．ＢＫ１３２ ＡＣＣ ＡＹｌ７３９５１ Ｂ．ＵＳ．９８．１０５８ ｌ １ ＡＣＣ ＡＹ３３ｌ２９５ ｈｏｍｏｌ１ Ｄ．ＵＧ．９４．９４ＵＧｌ１４ ＡＣＣ Ｕ８８８２４ Ａｌ，ＫＥ．９４．Ｑ２３ ｌ ７ ＡＣＣ ＡＦ００４８８５ Ｏ２ ＡＧ．ＮＧ—ＩＢＮＧ ＡＣＣ Ｌ３９ｌ０６ Ｇ．ＢＥ．９６．ＤＲＣＢＬ ＡＣＣ ＡＦ０８４９３６ Ｊ．ＳＥ．９４．ＳＥ７０２２ ＡＣＣ ＡＦ０８２３９５ Ｆ２．ＣＭ．０２．０２ＣＭ ０Ｏｌ６ＢＹ ＡＣＣ ＡＹ３７Ｉ１５８ ０７ ＢＣ．ＣＮ．９７．ＣＮ５４ ＡＣＣ ＡＸ１４９７７ｌ Ｏ８ ＢＣ．ＣＮ．９７．９７ＣＮＧＸ６Ｆ ＡＣＣ ＡＹ００８７ １ ５ ｈｏｍｏ６ Ｃ．ＺＡ．０４．ＳＫｌ ６４Ｂ ｌ ＡＣＣ ＡＹ７７２６９９ ｈｏｍｏ３ ｈｏｍｏ５ Ｏｌ ＡＣ．ＴＨ．９０．ＣＭ２４０ ＡＣＣ Ｕ５４７７ ｌ ｈｏｍｏ８ ｈｏｍｏｌ ｈｏｍｏ２ Ｈ．ＢＥ．９３．Ｖ１９９ｌ ＡＣＣ ＡＦｌ９０ｌ２７ Ｋ．ＣＤ．９７．Ｅ０ＴＢ１ ｌＣ ＡＣＣ ＡＪ２４９２３５ Ｏ．ＳＮ．９９．ＳＥＭＰ１３００ ＡＣＣ ＡＪ３０２６４７ 图３ １１例北京同性恋感染者体内ＨＩＶ－１毒株的系统进化树 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ １１ ｈｏｍｏｓｅｘｕａｌｓ ｆｒｏｍ Ｂｅｉｊｉｎｇ 本研究选择了分别针对ＨＩＶ一１ ｇａｇ、ｐｏｌ、ｇｐ４１ ３个 室诊断的传染性疾病。建立早期、准确、可靠的诊断 方法是及时治疗患者，防止疫情传播的关键所在。目 保守区段的敏感引物，建立了２５ 小体积的多重 前，血清学方法，即抗体检测，仍然是诊断ＨＩＶ感染的 ｎＰＣＲ和ＲＴ．ＰＣＲ检测方法，不仅大大地节省了成本， 主要方法。除此以外，核酸检测，包括血浆病毒ＲＮＡ 还可以将除了Ｔａｇ酶以外的整个反应体系都预先配 检测和前基因组ＤＮＡ的检测，是目前ＨＩＶ感染最重 制并分装冻存，统一进行ＰＣＲ检测，从而达到简化操 要的辅助诊断手段。与抗体检测相比，核酸检测可以 作、减少污染的目的。 更早的获得阳性结果，从而大大地缩短“窗口期”，此 在本实验检测的１５０份阳性标本中，只有３份标 外还用于１８个月内的婴儿及抗体检测结果“不确定” 本在３套引物系统的检测结果为阴性。这３例患者 等患者的检测 Ｊ。现有的核酸检测商品化试剂盒，包 均为男性同性恋感染者，正在接受抗病毒治疗，ＨＩＶ 括ＲＴ．ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ｂＤＮＡ等，都是ＨＩＶ ＲＮＡ的定量 ＲＮＡ水平在ＮＡＳＢＡ的检测限以下。以ＨＩＶ Ｃ２一Ｃ３区 检测试剂盒，检测成本高，需要专门的仪器、试剂，且 特异引物也未能扩增出阳性条带，因此未能做亚型鉴 在血浆ＲＮＡ水平较低的患者（病 主要是针对欧美流行的Ｂ亚型设计的，对非Ｂ亚型的 定。有文献ｒ 报道，检测能力相对较差，不适于在我国这样的发展中国家 毒载量低于１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ），不仅ＲＴ．ＰＣＲ的检测敏感 性会显著下降，由于其前病毒ＤＮＡ的含量较低， 推广。 既往的研究 ．４ 表明，利用ＰＣＲ技术进行ＨＩＶ的 ｎＰＣＲ的检测敏感度也会下降。本研究尝试将第２轮 核酸的定性检测不仅能够获得非常高的检测敏感性、 ＰＣＲ反应的模板量增加到５ ，结果其中的２例可以 特异性，而且不需要昂贵的仪器、设备，价格低廉，便 得到阳性结果（１份标本ｇｐ４１系统阳性，另外１份标 于操作。然而，长期以来直接扩增ＰＣＲ技术在 本的ｐｏｌ和ｇｐ４１系统阳性）。因而猜测“前病毒ＤＮＡ ＨＩＶ诊断中广泛应用的原因主要有以下几个：①由于 水平过低”是这２例样本ｎＰＣＲ检测阴性的原因，而 ＨＩＶ的高变异性，单一引物ＰＣＲ很难获得理想的敏感 另１例样本未得到阳性结果。度＿６ ；②多套引物联合检测的巢式ＰＣＲ方法具有更 ＮＡＳＢＡ法是一种由一对ｇａｇ区引物引导的特异 高的检测敏感度、特异度，但同时也增加了操作步骤， 性核酸序列扩增技术，是目前应用最为广泛的ＨＩＶ核 增加了检测成本和污染概率；③由于ＰＣＲ的高灵敏 酸定量检测方法之一。本实验所建立的ＰＣＲ检测方 法表现出比ＮｕｅｌｉＳｅｎｓ。ＨＩＶ一１ ＱＴ更高的检测敏感性， 度，在操作过程中容易污染，造成假阳性。 第６期 代丽丽等：１型ＨＩ￣感染多重ＰＣＲ检测方法的建立及临床应用 可能的原因有：①ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ。ＨＩＶ．１ ＱＴ所公布的 们的前病毒ＤＮＡ储存库仍然存在。 ＬＯＤ（１ｉｍｉｔｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，检测限）值是以１ ｍＬ样本量 在ＨＩＶ感染后的４～１１ ｄ，病毒血症出现，并迅速 进行研究的结果。通常所使用的１００～２００ Ｌ血浆 达到很高的水平（通常在１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ左右）。核酸 Ｖ感染的主要手段，平均比抗体检 量，虽然是在该试剂盒所允许的样本量范围内（１０～２ 检测是早期诊断ＨＩｍＬ），但是，对一些极低病毒载量样本的检测能力会 测提早２５ ｄ。抗体检测阴性或不确定，而病毒载量值 有一定下降 ８ ；②ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ。ＨＩＶ．１ ＱＴ只包含一对 较低（＜１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ）的情况有２种可能：①污染造 针对ＨＩＶ一１ ｇａｇ区的引物，如果发生该段序列的变异， 成的假阳性；②急性感染后期，血浆病毒载量已经降 将会直接影响其检测敏感性。我们设计的ＰＣＲ方法 至到了调定点。如果抗体在随访过程阳转，则可以确 联合应用了针对ｇａｇ、ｐｏｌ、ｇｅ４１ ３个保守区段的引物 系统，大大减低了由于基因变异造成的假阴性率；③ ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ。ＨＩＶ一１ ＱＴ主要是根据欧美流行的Ｂ亚型 设计的，非Ｂ亚型的检测能力相对较差 Ｊ。本研究设 计的ＰＣＲ方法包含了能覆盖我国各主要流行株亚型 的３套引物系统，很大程度上可以避免由于亚型不符 而造成的假阴性；④ｎＰＣＲ方法检测的是整合在宿主 基因组的前病毒ＤＮＡ，即便在血浆ＲＮＡ阴性的患者 仍然可以获得阳性结果。 虽然理论上，ＰＣＲ可以检测出低至一个拷贝的核 酸序列，但一般认为，对病毒载量低于１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ的 患者，ＲＴ－ＰＣＲ的检测敏感性会减低。在我们的研究 中，ＲＴ—ＰＣＲ在病毒载量大于１０ ｃｏｐｙ／ｍＬ的患者中具 有非常高的检测敏感性，而在病毒载量阴性患者中的 检测敏感性则降低。这主要因为，在血浆ＲＮＡ含量 过低的情况下，ＰＣＲ体系中所加入的少量模板可能恰 好没有包含目的核酸分子，或扩增的产物量没能达到 可以检测的水平。 ｎＰＣＲ方法检测的是整合到宿主基因组中的前病 毒ＤＮＡ，其含量受血浆ＲＮＡ水平的影响相对较小。 然而，有研究＿】 表明，前病毒ＤＮＡ的含量与血浆 ＲＮＡ水平间仍存在着一定的相关性：在血浆ＲＮＡ水 平较低的患者，其前病毒ＤＮＡ的含量也较低。Ｓｈａｎ． ｎｏｎ Ｍ Ｍ等 ｕ建立的ＨＩＶ ＤＮＡ ＰＣＲ扩增体系对高病 毒载量组的检测敏感性高于对低病毒载量组的检测 敏感性。Ｆｒａｎｃｅｓｃａ Ｖ等 还观察到ＨＩＶ ＤＮＡ在 ＨＡＡＲＴ过程中会有缓慢下降，并提出可能与病毒储 存库的消耗有关。 在本研究中，检测ＨＩＶ前病毒ＤＮＡ的ｎＰＣＲ方 法在血浆病毒载量阴性患者中的检测敏感性也有下 降，但远高于ＲＴ．ＰＣＲ方法。那些血浆病毒被长期抑 制的ＨＡＡＲＴ患者（有４例患者的病毒载量已经阴转 ２４个月以上），虽然ＲＴ－ＰＣＲ未能检测到血浆ＨＩＶ ＲＮＡ的存在，但是ｎＰＣＲ仍能获得阳性结果，说明他 定是急性感染。核酸ＰＣＲ检测方法具有简单、快速、 经济等特点，可以帮助尽早的确定诊断。 根据“全国艾滋病毒分子流行病学调查”项目的研 究结果，ＢＣ、Ｂ’、和ＡＥ亚型是我国流行的最主要亚型， 占总数的９４．８５％。我们检测的样本中绝大部分都属 于这些亚型，说明我们建立的ＰＣＲ检测体系能够对我 国这些主要的病毒亚型达到很高的检测敏感性。 目前，在欧美等发达国家，ＨＩＶ病毒核酸定量检 测试剂盒已经被广泛应用到血液筛查等领域，但是对 大多数发展中国家而言，建立一套简便、经济、敏感、 特异的ＨＩＶ ＰＣＲ定性检测方法则意义非凡。本研究 不仅建立了一套经济、实用的ＨＩＶ ＰＣＲ检测方法，而 且对ｎＰＣＲ和ＲＴ—ＰＣＲ的检测敏感性及其受血浆ＲＮＡ 水平的影响程度等问题都做了比较研究，为其进一步 临床应用奠定基础。 ４参考文献 ［１］０ｕ ｃ Ｙ，Ｋｗｏｋ Ｓ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｓ Ｗ，ｅｔ ａ１．ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ．１ ｉｎ ＤＮＡ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９：２９５－２９７． ［２］Ｙａｎｇ Ｃ，Ｐｉｅｎｉａｚｅｋ Ｄ，Ｏｗｅｎ Ｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙ— ｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇｒｏｕｐｓ Ｍ ａｎｄ Ｏ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｈｉｓｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｉｔｃ ｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，３７： ２５８１—２５８６． ［３］Ｖａｎ Ｌａｅｔｈｅｍ Ｋ，Ｂｅｕｓｅｌｉｎｃｋ Ｋ，Ｖａｎ Ｄｏｏｒｅｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｄｉａｇ— ｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｐｏｌｙ— ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈａｒｂｏｕｒｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９９８，７０：１５３—１６６． ［４］ 魏民，关琪，梁浩，等．人免疫缺陷病毒１型感染基因诊 断方法的建立［Ｊ］．中华检验医学杂志，２００３，２６：７７２— ７７６． ［５］ Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅ Ｎ Ｔ，Ｚｉｎｋ Ｈ．ＨＩＶ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｆｔｅｒ ｔｗｏ ｄｅｃａｄｅｓ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ，２００５， １２１：５１９－５３８． ６９４ 首都医科大学学报 第３１卷 《首都医科大学学报》获“第三届中国高校优秀科技期刊奖” 为了不断促进高校科技期刊的发展，提高期刊的学术质量和编辑出版质量，扩大我国高校科技期刊在国内 外的影响，对科技期刊在科学活动和文献交流中所起的作用及其质量作出客观、全面的评价，在教育部科技司 的领导下，中国高等学校自然科学学报研究会常务理事会进行了“第三届中国高校精品・优秀・特色科技期 刊”的评比。《首都医科大学学报》在评比中获“第三届中国高校优秀科技期刊奖”。 “第三届中国高校优秀科技期刊”的评比采用中国学术期刊（光盘版）电子杂志社编写的《中国学术期刊综合 引证报告》的评价数据，依据学术（技术）质量评比标准和编辑出版质量评比标准给参评期刊打分并排序。学术评 价指标包括：１）离均差率；２）总被引频次；３）影响因子；４）他引总引比；５）基金论文比；６）平均引文数；７）论文下载 率；８）被国内外重要检索系统收录数；９）互引指标等。编辑出版质量评价包括编校质量和出版质量。 这是《首都医科大学学报》继２００６年获“首届中国高校优秀科技期刊奖”后再次获得该项殊荣。这既是对 《首都医科大学学报》以往工作的肯定，也是对今后工作的鞭策，《首都医科大学学报》工作人员将再接再励，积 极探索、改革创新，充分发掘并发挥好高校的办刊优势，不断提升《学报》的影响力和竞争力，为高校教学、科研 和社会服务做出新的贡献，也争取在期刊的学术水平和编校质量上再上一个新的台阶。
