高效液相色谱法测定螺旋藻中几种色素的研究_王林

文章编号:1001-4721(2005)02-0057-04

高效液相色谱法测定螺旋藻中几种色素的研究

王林,朱惠贤,章新,吴献花,胡秋芬

(玉溪师范学院化学与环境科学系,云南玉溪653100)

摘 要:目的 建立螺旋藻中主要色素成分(叶绿素-a、叶绿素-b、叶黄素、B-胡萝卜素和新叶黄素)的高效液相色谱快速分析方法。方法 螺旋藻中的色素用90%的丙酮提取,以安捷仑ZORBAXStableBound(2.1@50mm,1.8Lm)色谱柱为固定相,四氢呋喃和水梯度洗脱为流动相,用二极管矩阵检测器检测。结果 5种色素在2.0min内分离,标准回收率为98%~102%,相对标准偏差为1.1%~1.4%。结论 本方法样品前处理简便、快速,分析时间比常规色谱柱大大缩短,较常规色谱柱流动相消耗减少,结果满意。

关键词:高效液相色谱;固相萃取;螺旋藻;色素

中图分类号:O657.7+2;Q949.2 文献标识码:A

螺旋藻属是一种新型食品能源。其蛋白质含量高,氨基酸组成可与鸡蛋、牛奶相媲美,且易被人体和动物消化吸收;此外,还含有丰富的维生素原和色素,可作为食品的天然添加剂。因此,近年来螺旋藻引起了各国生物技术开发部门的广泛重视。天然植物色素是螺旋藻中的重要营养成分,目前色素的测定方法主要有光度法和色谱法,其中高效液相色谱法是最有效的方法[3~5]。由于微柱高效液相色谱具有流动相消耗小、分析时间短、可不分流直接和质谱连用等特点,近几年来得到了迅速发展[7,8]。我们研究了用安捷仑ZORBAXStableBound(2.1@50mm,1.8Lm)微柱高效液相色谱分析螺旋藻中色素的方法,几种主要的色素成分在2.0min内可达到基线分离,大大缩短了分析时间,而且流动相流速只需0.3mL/min。

1 试验部分

111 主要仪器与试剂

美捷仑公司1100高效液相色谱仪,包括HP1100四元泵、HP1100紫外二极管矩阵检测器、HP1100自动进样器、ChemStation色谱工作站。丙酮和四氢呋喃:高效液相色谱专用(Fisher公司生产);水为石英亚沸蒸馏水并用Milli-Q50(美国Millipore公司)超纯水仪处理;叶绿素-a、叶绿素-b、叶黄素、B-胡萝卜素和新叶黄素标样(分别购于Fluka公司和Sigma公司,含量>95%)。112 色谱条件

色谱柱为ZORBAXStableBound(2.1@50mm,1.8Lm);流动相为四氢呋喃和水梯度洗脱,梯度变化为0min(50%四氢呋喃+50%水)、4min(65%四氢呋喃+35%水),流速为0.3mL/min;进样体积5.0LL。各色素均在最大吸收波长下检测,上述色谱条件下样品

收稿日期:2004-11-15

基金项目:玉溪师范学院科研基金及云南省自然科学基金资助项目。

作者简介:王林(1956-),男,云南普洱人,副教授,主要从事植物学的教学与研究。 58特 产 研 究2005年

和标样在450nm波长处色谱图,见图1。113 样品处理

准确称取螺旋藻0.5g,加入10mL90%的丙酮匀浆5min(8000r/min),将匀浆液放入50mL的离心管中,加入10mL90%的丙酮,超声提取15min,然后离心(4000r/min)10min,将上清液转移至试管中,搅拌残渣,再分2次用10mL90%的丙酮各超声提取10min,离心,合并3次上述清液并定容到50mL;取1.0mL的提取液用0.25Lm微孔滤膜过滤,按选定色谱条件进样5.0LL测定。

(1)新黄质,(2)叶黄素,(3)叶绿素-a,(4)叶绿素-b,(5)B-胡萝卜素

图1 螺旋藻样品(a)和色素标样(b)色谱图

2 结果与讨论

211 分离条件的选择

植物色素的分离需用溶剂强度较强的流动相,四氢呋喃-水为最常用的体系,因此,试验选用该流动相。实验表明,用梯度洗脱各色素基本能达到基线分离且分析时间短,因此实验选用梯度洗脱,试验了不同的梯度条件。合理梯度条件为:0min(50%四氢呋喃+50%水)、4min(65%四氢呋喃+35%水),线性递增的梯度条件。212 主要色素的光谱特征及检测波长的选择

由紫外二极管矩阵检测器可得各主要色素峰的光谱图(图2),为了减少各组分的相互干扰及定量误差,各组分均在其最大波长下检测。即叶黄素检测波长为444.9nm,B-胡萝卜素检测波长为452.1nm,叶绿素-a检测波长为9.5nm,叶绿素-b检测波长为6.2nm,新叶黄素检测波长为442.4nm。213 样品前处理

本实验采用将样品与90%的丙酮混合后匀浆,能将螺旋藻和提取溶剂充分混匀,提高样品的溶出率。实验表明,用10mL的90%的丙酮分3次提取可让样品中的色素完

(1)叶黄素,(2)B-胡萝卜素,(3)叶绿素-a,(4)叶绿素-b,(5)新黄质

图2 螺旋藻中主要色素的光谱图

全提出,故实验采用10mL90%的丙酮分3次提取样品。由于在色素的检测波长下其它共存成分吸收很弱,基本不干扰色素的测定,提取液过滤后可直接进样分析。214 回归方程、相关系数及检测限

分别配制浓度为100Lg/mL、20Lg/mL、4.0Lg/mL、0.8Lg/mL的标准溶液,进样后根据不同浓度的峰面积计算出回归方程,结果见表1。根据信噪比S/N=3,测得各组分最低检测浓度,结果见表1。

第2期王林等:高效液相色谱法测定螺旋藻中几种色素的研究

回归方程、相关系数及检测限

59

表1

组 分叶绿素-a叶绿素-b叶黄素B-胡萝卜素新叶黄素

回归方程

A=3.86@105C(Lg/mL)+287A=2.87@105C(Lg/mL)-428A=2.02@105C(Lg/mL)+387A=2.15@105C(Lg/mL)-455A=2.13@105C(Lg/mL)-472

相关系数r=0.9995r=0.9998r=0.9996r=0.9998r=0.9994

检测限2018253530

215 回收率实验及精密度

准确称取相同样品2份,其中1份加入已知量色素标样,另1份不加,在相同条件下测定5次,通过加入标准的测出量除以标准加入量计算回收率,并根据5次平行测定的结果计算相对标准偏差,结果见表2。 表2

组 分叶绿素-a叶绿素-b叶黄素B-胡萝卜素新叶黄素

方 法 精 密 度 及 回 收 率

加入量(mg)

1.01.01.01.01.0

测出量(mg)

0.960.940.971.010.92

回收率(%)

969497101102

RSD%(n=5)

2.11.82.12.32.6

216 样品分析结果

螺旋藻样品按1.3的方法进行前处理,然后按选定色谱条件进样分析,结果见表3。 表3

组 分

螺旋藻(云南)

叶绿素-a叶绿素-b叶黄素B-胡萝卜素新叶黄素

5.421.1.561.470.2

6.422.181.941.620.752

样 品 分 析 及 结 果

样 品 (mg/g)

螺旋藻(海南)

螺旋藻(浙江)

6.212.111.841.830.721

螺旋藻(福建)

6.082.051.881.650.684

3 结论

本方法采用90%的丙酮超声提取,快速分离柱高效液相色谱法测定螺旋藻中主要色素成分。样品前处理方法简便、快速,且5种主要色素在2.0min内可达到基线分离,分析时间比常规色谱柱大大缩短;而且流动相流速只需0.3mL/min,比常规色谱柱(流动相流速0.5~2.0mL/min)流动相消耗减少,该方法的建立在一定程度上为螺旋藻中的色素快速测定提供了方法。 60特 产 研 究2005年

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StudyontheDeterminationofPigmentsinSpringerbyHigh

PerformanceLiquidChromatography

WANGLin,ZHUHu-ixian,ZHANGXin,WUXian-hua,HUQiu-fen

(DepartmentofChemistry,YuxiTeachers.College,YuxiYunnan,653100,china)

Abstract:Objective Toestablishahighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodforthedeterminationofpigments(chlorophyll-a,chlorophyll-b,B-carotene,lutein,neoxanthin)inspringer.Method Thepigmentswereextractedfromthesamplewith90%ofacetone.Then,thepigmentswasseparatedonaZORBAXStableBound(2.1@50mm,1.8Lm)column,withTHFandwaterasmobilephaseataflow-rateof0.3ml/min,andmonitoredwiththephotodiodearraydetectorat450nm.Result Thefourpigmentswereseparatedcompletelywith-in2.0min.Therecoveriesofthepigmentswere98%~102%,andrelativestandarddeviationswere1.1%~1.4%.Resultsaresatisfactory.Conclusion Inthismethod,thesamplepreparationissimple.Theseparationtimegreatlyshortenandsolventconsumptionissaved.Theresultsaresatisfactory.

Keywords:highperformanceliquidchromatography;solidphaseextraction;pigments;springer(上接第53页)

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TheResearchonOfficinalInsectResourceintheQilianMountainsNationalNatureReserve

HAOHu,FENGWe-idong,WANGLing

(TheManagementBureauofGansuQilianMountainsNationalNatureReserve,ZhangyeGansu734000,China)Abstract:7orders,16familiesand32speciesofficinalinsectarefoundintheQilianMountains.Keywords:QilianMountains;officinalinsect