第４１卷第６期 ２０１ １年１１月 温州医学院学报 Ｖｏ１．４１ Ｎｏ．６ Ｎｏｖ．２０１ １ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｗｅｎｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ■ 大鼠ＳＬＣＴａ８基因的克隆及真核表达载体的构建 王本极 ，黄晓燕 ，林素 ，周希 ，戴晓春 ，方俊旭 ，杨德业 （１．温，Ｊｉ、Ｊ医学院附属第一医院 心内科，温州医学院心血管生物和基因研究所，浙江 温Ｊｉ、 ３２５０００ ｌ２．温州医学院眼视光学院，浙江温州３２５０００） ■ ［摘要］目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体（ＳＬＣ７ａ８）基因ｅＤＮＡ的读码框（ＣＤＳ），构建携带ＳＬＣ７ａ８基 因的重组真核表达载体，为进一步研究其在自发性高血压大鼠（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔｓ，ＳＨＲ） 中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠（ｗｉｓｔａｒ—ｋｙｏｔｏ，ＷＫＹ）肾脏组织提取总ＲＮＡ，通过ＲＴ．ＰＣＲ得到总 ｃＤＮＡ，ＰＣＲ法扩增，产物连接ｐＧＥＭ—Ｔ Ｅａｓｙ载体测序分析正确后，再以ＰＣＲ方法扩增，将其连接入真核表 达质粒ｐｅＤＮＡ３．１（＋）。以ＰＣＲ、双酶切和测序鉴定正确后，将重组载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＳＬＣ７ａ８用脂质体包裹 转染大鼠肾小管上皮细胞（ＮＲＫ ５２Ｅ），ＲＴ—ＰＣＲ法及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法分别检测转染后ＳＬＣ７ａ８ ｍＲＮＡ及 蛋白表达水平。结果：成功克隆了大鼠ＳＬＣＴａ８基因ｃＤＮＡ，重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＳＬＣＴａ８构建 成功，且证实转染后肾小管上皮细胞的ＳＬＣ７ａ８ ｍＲＮＡ及蛋白表达均明显高于空白对照组（Ｐ＜０．０５）及空 质粒组（Ｐ＜０．０５）。结论：成功克隆了ＳＬＣ７ａ８基因，并构建了真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＳＬＣ７ａ８，能够 在ＮＲＫ一５２Ｅ细胞中获得有效过表达，这为进一步探讨ＳＬＣＴａ８基因的生物学功能奠定了基础。 ［关键词］ 真核表达载体；ＳＬＣ７ａ８；肾小管上皮细胞；基因；大鼠；克隆 ［中图分类号］Ｒ５４４．１；Ｑ７８［文献标识码］Ａ［文章编号］１０００－２１３８（２０１１）０６—０５１５—０５ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｒａｔ ＳＬＣＴａ８ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ＷＡＮＧ Ｂｅｎｊｉ ， ＨＵＡＮＧ Ｘｉａｏｙａｎ。ＬＩＮ Ｓｕ。ＺＨＯＵ Ｘｉ。ＤＡＩ Ｘｉａｏｃｈｕｎ，ＦＡＮＧ Ｊｕｎｘｕ ＹＡＮＧ Ｄｅｙｅ． ＊Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｌｔａｌ ｏｆ Ｗｅｎｚｈｏｕ ＭｅＳｃａｌ ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏ－ ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｗｅｎｚｈｏｕ Ｍｅ ｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ．Ｗｅｎｚｈｏｕ．３２５０００ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｃ１ｏｎｅ ｒａｔ ＳＬＣ７ａ８ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｉｔｓ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ＳＨＲ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｋｌｄｎｅｙ ｔｉＳＳＨｅ．ＳＬＣ７ａ８ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ，ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐＧＥＭ—Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ＳＬＣＴａ８ ｃＤＮＡ ｗａｓ ａｌｓｏ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ，ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｐｌａｓｍｉｄ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＰＣＲ，ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＳＬＣ７ａ８ ｗａｓ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＮＲＫ・５２Ｅ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｌｎ ＴＭ ２ ０００．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＬＣ７ａ８ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｏｆ ＳＬＣ７ａ８ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ．ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅＳｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ． Ｏｖｅｒ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＬＣＴａ８ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ＮＲＫ－５２Ｅ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＳＬＣ７ａ８ ｇｅｎｅ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｅｌ１ｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌ１ｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ（ｂｏｔｈ Ｐ＜０．０５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＳＬＣ７ａ８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｏｖｅｒ— ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＬＣ７ａ８ ｇｅｎｅ ｉｎ ＮＲＫ一５２Ｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓ． ｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉ１１ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｒｏｌｅ ｏｆ ＳＬＣ７ａ８ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉＯｎ． ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ；ＳＬＣ７ａ８；ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；ｇｅｎｅｓ； ｒａｔｓ：ｃｌｏｎｅ 原发性高血压（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，ＥＨ） 是一种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的多 收稿日期：２０ｌ １—０５—３０ 基金项目：温州市科技发展计划基金资助项目（Ｓ２０ ０ ２Ａ１ ３２）。 基因遗传性疾病，是导致脑血管意外和冠状动脉疾 作者简介：王本极（１ ９ ８ ６一），男，浙江苍南人，硕士生。 通讯作者：杨德业，教授，主任医师，博士生导师，Ｅｍ ａ ｉ ｌ： ｄｅＹｅｙａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ。 病的重要危险因素。近２０年来的研究发现多巴胺及 其受体和影响其信号转导均和高血压密切相关ｌ】＿２】， 肾脏组织的肉分泌和旁分泌多巴胺对保持血压的动 一５１５— 第４１卷 温州医学院学报 态平衡起着至关重要的作用。肾近端小管缺乏参与 多巴胺合成的酪氨酸羟化酶，但能重吸收循环滤过 取ＷＫＹ大鼠肾脏组织总ＲＮＡ，以此为模板，ｏｌｉｇｏ—ｄＴ 为引物，ＲＴ—ＰＣＲ合成ｃＤＮＡ。根据ＧｅｎｅＢａｎｋ中大鼠 ＳＬＣＴａ８序列设计引物，上游引物（Ｆ１）：５’．ＧＣＴＧＴＣＡ ＣＴＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＡＧＧＡＧ－３’，下游引物（Ｒ１）：５’一ＣＡＧＧＧ ＡＴＡＣＡＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡ一３’，用Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲＴＭ ＨＳ ＤＮＡ 的左旋多巴（Ｌ－ＤＯＰＡ），通过芳香族氨基酸脱羧而合 成多巴胺。研究发现ＳＬＣＴａ８（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍ－ ｉｌｙ ７，ｍｅｍｂｅｒ８）基因编码的蛋白为２型左旋氨基酸 转运体（ｔｙｐｅ ２ Ｌ—ｔｙｐｅ ａｍｉｎｏａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ， Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ扩增ＳＬＣ７ａ８编码序列，ＰＣＲ反应条件 为：９４。Ｃ预变性５ ｍｉｎ；９８。Ｃ变性１０ Ｓ，５７．８。Ｃ ＬＡＴ２），是氨基酸转运体的轻链构成部分，决定了转 运体的性质，该转运体可调节肾小管顶端和基底侧 的Ｌ－ＤＯＰＡ摄取ｌ。Ｊ。我们实验室采用自发性高血压大 鼠（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔｓ，ＳＨＲ）和 非高血压大鼠（ｗｉｓｔａｒ—ｋｙｏｔｏ，ＷＫＹ）为动物模型， 用基因芯片技术初步筛选出新的高血压相关基因， 芯片发现ＳＬＣＴａ８基因的表达水平在ＳＨＲ组中比ＷＫＹ 退火１５ Ｓ，７２。Ｃ延伸２ ｍｉｎ，循环３５次，最后７２ 。Ｃ延伸５ ｍｉｎ。扩增产物用１．５％的琼脂糖凝胶电泳 分析。胶回收目的片段，以ＴＡＫＡＲＡ公司的ｒＴａｑＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ在片段３’平末端后加上Ａ尾，与ｐＧＥＭ— Ｔ Ｅａｓｙ载体连接后，转化感受态细菌ＤＨ５ ，菌落 ＰＣＲ快速鉴定，挑取数个阳性克隆抽提质粒，测序 鉴定。 组上调９．３倍｜４Ｉ，为了进一步研究ＳＬＣ７ａ８基因与高 血压形成、发展的关系，本实验室构建了携带该基 因的真核表达载体，为探讨ＳＬＣ７ａ８在高血压形成发 展中的生物学功能作准备。 １材料和方法 ｉ．ｉ材料高保真ＤＮＡ聚合酶Ｐｒ ｉｍｅ ＳＴＡＲＴＭ ＨＳ ＤＮＡ １．２．３重组载体的构建及鉴定：设计引物，上游引 牛勿（Ｆ２）：５’－ 垒垒 至ＧｃＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴｃＧＧＡＡｃ ＣＣＴＡＣＧＧ一３’（划线部分依次是保护碱基，Ｈｉｎｄ １１酶 切位点）。下游引物（Ｒ２）：５’．ＧＧＣ ＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＧＡ ＴＡｃＡＧＧＧｃＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡ一３’（划线部分依次是保护碱 基，Ｋｐｎ Ｉ酶切位点）。含ＳＬＣ７ａ８基因ＣＤＳ的ｃＤＮＡ 的ｐＧＥＭ—Ｔ Ｅａｓｙ载体为模板，以“Ｆ２、Ｒ２”为引物、 Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ购自ＴＡＫＡＲＡ公司；性内切酶均购 自ＮＥＢ公司；ｐＧＥＭ．ｒ Ｅａｓｙ载体、Ｔ４连接酶购自 Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＤＨ５ 菌种，超级感受态细胞制备 试剂盒购自碧云天生物技术研究所；ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）、ＦＢＳ、０．０５％胰酶／ＥＤＴＡ、Ｈａｎｋｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ均购自Ｇｉｂｃｏ；Ｔｒｉｚｏｌ、Ｌｉｐｏｆｅｅｔ． ａｍｉｎｅＴＭ ２０００转染试剂、ＤＥＰＣ水（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ａｎｄ ＤＮａｓｅ—ｆｒｅｅ）均购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＲＴ试剂盒（Ｆｅｖｅｒ— ｔａｉｄＴＭ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ）、ＤＮａｓｅ 扩增ＳＬＣＴａ８编码序列，ＰＣＲ反应条件为：９４℃预 变性５ ｍｉｎ；９８。Ｃ变性１０ Ｓ，５６。Ｃ退火Ｉ５ Ｓ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，循环３ｏ次，最后７２。Ｃ延伸５ ｍｉｎ。 扩增产物用１．５％的琼脂糖凝胶电泳分析。ｐｃＤＮＡ３．１ （十）真核表达载体与ＰＣＲ产物分别经Ｈｉｎｄ ｉｉｉ、Ｋｐｎ Ｉ 双酶切。Ｔ４连接酶连接双酶切后产物（４℃，１６ ｈ） 后，转化ＤＨ５ 感受态细菌，在含有氨苄西林抗性 ＬＢ平板上培养过夜，挑选菌落，提取质粒后，经 ＨｉｎｄⅢ、Ｋｐｎ Ｉ双酶切和ＰＣＲ鉴定阳性克隆并测序 Ｉ（ＲＮａｓｅ—ｆｒｅｅ １０ ＩＵ／Ｌ）购自Ｆｅｒｍａｎｔａｓ；Ｗｅｓｔ— ｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｉ￣ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ＳＬＣ７ａ８ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ购自ＡＶＩＶＡ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ⅱ抗ｇｏａｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｔｏ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ购自Ａｂｃａｍ；ＷＫＹ大鼠 肾脏组织、ＰＣＤＮＡ３．１（＋）载体由本实验室保存；质 粒抽提试剂盒均购自Ｏｍｅｇａ公司；大鼠肾小管上皮 细胞（ｒａｔ ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ一５２ｅ， 分析，得到阳性载体。测序由上海英骏生物技术有 限公司完成。 １．２．４脂质体转染：实验分空白对照组（ＢＣ组）： 即未作任何处理；空质粒组（Ｎｃ组）：转染１．２ ｇ ｐｃＤＮＡ ３．１（十）空载体组；实验组（Ｐ－ＳＬＣ７ａ８组）： 转染１．２ ｇ重组载体ｐｃＤＮＡ３．１（十）一ＳＬＣ７ａ８。ＮＲＫ一５２Ｅ 细胞常规培养于含５％胎牛血清的ＤＭＥＭ（高糖）中。 转染前２４ ｈ收集细胞，以ｌ×１Ｏ 孔的密度接种于 ＮＲＫ一５２Ｅ），购自中国科学院上海生命科学研究院细 胞资源中心。 １．２方法 ６孔板中。待细胞生长达４０％＇－－－６０％融合度时，用无 血清ＤＭＥＭ培养基清洗２次，按Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２ ０００ 说明书进行转染。转染６ ｈ后，换为含５％胎牛血清 的ＤＭＥＭ，在３７。Ｃ的５％ｃ０ 培养箱继续培养４８ ｈ 后，进行下一步实验检测。 １．２．１ 超级感受态细菌的制备：根据碧云天的超级 感受态制备试剂盒制备Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ 感受态，并测 定转化效率。 １．２．２ ＳＬＣ７ａ８基因的ｃＤＮＡ克隆：用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提 第４１卷 王本极，等：大鼠ＳＬＣ７ａ８基因的克隆及真核表达载体的构建 第６期 毒载体相比，无免疫原性和潜在的不良反应，也不 会引起病毒播散。含有氨苄青霉素（ａｍｐｉｃｉ儿ｉｎ） 和新霉素（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）抗性基因，利于载体在大肠 起着重要作用，这与高血压的病理生理机制密切相 关。我们研究的目的就是试图寻找ＳＬＣ７ａ８与高血压 之间的相关性，本研究中成功构建ＳＬＣ７ａ８真核表达 载体，并成功转染ＮＲＫ－５２Ｅ细胞，这为我们进一步 探索ＳＬＣ７ａ８基因的生物学功能、转基因研究及进一 步明确该基因与高血压的相关性奠定必要的基础。 杆菌中扩增和稳定表达的转染细胞筛选，而脂质体 介导的真核细胞转染能方便有效地将外源基因转入 靶细胞。 ＳＬＣ７ａ８基因编码的蛋白为ＬＡＴ２，ＬＡＴＩ和ＬＡＴ２ 均属于ＳＬＣ７家族。ＬＡＴ２是氨基酸转运体的轻链构 成部分，而轻链（ＬＡＴ２）在氨基酸转运过程中起重 要作用Ｉｓ］，该蛋白在体内主要表达在肾脏、肠、视 网膜上皮和牙蕾等组织＿６】。目前研究发现ｒＢＡＴ和 参考文献： ［１］ Ｉｉｍｕｒａ Ｏ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｗａｔｅｒ－－ｓｏｄｉｕｍ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｋｉｄｎｅｙｓ ａｔ ｔｈｅ ｐｒｅｈｙｐｅｒ・－ ｔｅｎｓｉｖｅ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ【Ｊ］．Ｊ Ａｕｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９０，１０（Ｓｕｐｐｌ １）：ｓ７３一ｓ７７． 【２］ Ａｌｂｒｅｃｈｔ ＦＥ，Ｄｒａｇｏ Ｊ，Ｆｅｌｄｅｒ ＲＡ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄ１Ａ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｙｐｅｒ— ＬＡＴ２调节肾小管顶端和基底侧左旋多巴的摄取［引， Ｓｏａｒｅｓ ｄａ—Ｓｉｌｖａ等Ｉｔ］在体外用肾ＬＬＣ—ＰＫ１上皮细胞 为研究对象也发现左旋多巴主要通过非Ｎａ 依赖的 ＬＡＴ２／４Ｆ２ｈｃ转运。肾脏内分泌和旁分泌多巴胺对保 ｔｅｎｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９９６，９７（１０）：２２８３－２２８８． 【３】 Ｑｕｉｎｏｎｅｓ Ｈ，Ｃｏｌｌａｚｏ Ｒ，Ｍｏｅ ＯＷ．Ｔｈｅ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｌ—ｄｉｈｙｄｒＯｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｉｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ 持Ｎａ 的动态平衡起着至关重要的作用，左旋多巴 通过肾近端小管上皮细胞从肾小球滤过物和血浆中 ｒａｎｓｐｏｒｔｔｅｒｓ ｒＢＡＴ ａｎｄ ＬＡＴ２ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｃｏｒｔｅｘ【Ｊ】．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，２８７（１）：Ｆ７４一Ｆ８０． 被摄取，为多巴胺的合成提供前体物质。低血液浓 度的多巴胺通过激动多巴胺受体起利钠扩血管从而 降压之作用，而较高血液浓度的多巴胺则主要通过 兴奋血管 受体，对全身血管（除冠状动脉外）均 产生强烈收缩反应，使血压升高。因此，血液中多巴 胺物质的增多，是导致高血压发生发展的重要机制 之一。 【４】 洪承吕，陈长曦，杨德业，等．新的高血压相关基因ＳＬＣ７Ａ８的 实验研究『Ｊ］．中国病理生理杂志，２００７，２３（１ １）：２１２２—２１２５． 【５】 Ｂｒｏｅｒ Ａ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｂ，Ｗａｇｎｅｒ ＣＡ，ｅｔ １．Ａｓｓｏｃｉａｔａｉｏｎ ｏｆ ４Ｆ２ｈｃ ｗｉｔｈ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ＬＡＴ１．ＬＡＴ２ ｏｒ ｙ＋ＬＡＴ２ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，２００１，３５５（Ｐｔ３）：７２５—７３１． 【６】 Ｂａｓｓｉ ＭＴ，Ｓｐｅｒａｎｄｅｏ ＭＰ，Ｉｎｃｅｒｔｉ Ｂ，ｅｔ ａ１．ＳＬＣ７ａ８，ａ ｇｅｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｌｙｓｉｎｕｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｇｉｏｎ，ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ—ａｓｓｏｃｉ— Ｐｉｎｈｏ等［８１以ＳＨＲ和ＷＫＹ为实验对象，比较两者 肾皮质ＬＡＴ２的表达及左旋多巴的摄取情况，结果发 现４～１２周时，ＳＨＲ对左旋多巴的摄取明显多于 ＷＫＹ，ＲＮＡ印迹发现肾脏中ＬＡＴ２的表达ＳＨＲ高于ＷＫＹ， ａｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆａｍｉｌｙ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９９，６２ （２）：２９７—３０３． ［７］ Ｓｏａｒｅｓ・ｄａ—Ｓｉｌｖａ Ｐ，Ｓｅｒｒａｏ ＭＰ．Ｈｉｇｈ—ａｎｄ ｌｏｗ—ａｆｉｎｉｆｔｙ ｔｒａｎｓ— ｐｏｒｔ ｏｆ Ｌ－－ｌｅｕｃｉｎｅ ａｎｄ Ｌ・－ＤＯＰＡ ｂｙ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ ＬＡＴ１ ａｎｄ ＬＡＴ２ ｉｎ ＬＬＣ－ＰＫ１ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌｓ【Ｊ】．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，２８７（２）：Ｆ２５２一Ｆ２６１． ［８］Ｐｉｎｈｏ ＭＪ，Ｇｏｍｅｓ Ｐ，Ｓｅｒｒａｏ ＭＰ，ｅｔ ａ１．Ｏｒｇａｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｖｅｒ— ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｎａｌ ＬＡＴ２ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｂｕｌａｒ Ｌ—ＤＯＰＡ 且４周时比１２周时更明显。这结果提示ＳＨＲ的肾脏 过度ＬＡＴ２可以增加Ｌ－ＤＯＰＡ的摄取，这种表现是器 官特异性的，而且预示着血压增高。在ＷＫＹ和ＳＨＲ的 肾近球小管上皮中，左旋多巴的摄取在ＷＫＹ几乎全部 ｕｐｔａｋｅ ｐｒｅｃｅｄｅ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ， ２００３，４２：６１３－６１８． 通过ＬＡＴ２，而ＳＨＲ ２５％通过ＬＡＴ２、２５％通过钠通道 【９】Ｐｉｎｈｏ ＭＪ，Ｓｅｒｒａｏ ＭＰ，Ｇｏｍｅｓ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｏｖｅｒ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｎａｌ ＬＡＴ １ ａｎｄ ＬＡＴ２ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌ—ＤＯＰＡ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ 依赖的转运系统Ｂ（０）、５０％通过ＬＡＴ１，且ＬＡＴ１和 ＬＡＴ２蛋白在ＳＨＲ中明显上调ｌ ９ｌ。Ｐｉｎｈｏ等［１０１最新的研 ＳＨＲ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｒｅｎａｌ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ【Ｊ】．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００４，６６（１）：２１６—２２６． 【１ ０］Ｐｉｎｈｏ ＭＪ，Ｓｅｒｒａｏ ＭＰ，Ｓｏａｒｅｓ—ｄａ—Ｓｉｌｖａ Ｐ．Ｈｉｇｈ—ｓａｌｔ ｉｎｔａｋｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｓｐｏｎ— 究发现，肾多巴胺系统与非钠依赖（ＬＡＴ１、ＬＡＴ２）氨 基酸转运体基因转录以及肾小管摄取Ｌ—ＤＯＰＡ有着密 切的联系。我们实验室采用ＳＨＲ和ＷＫＹ为动物模型， 用基因芯片技术初步筛选出新的高血压相关基因， 芯片发现１９个基因在ＳＨＲ中上调，其中ＳＬＣＴａ８基 因的表达水平在ＳＨＲ组中比ＷＫＹ组上调９．３倍［４］。 综上，ＳＬＣ７ａ８在肾脏组织左旋多巴的摄取 ｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２００７，２９２（５）：Ｆ１４５２一Ｆ１４６３． （本文编辑：吴健敏） 一５１９一
