第41卷第6期 201 1年11月 温州医学院学报 Vo1.41 No.6 Nov.201 1 Journal of Wenzhou Medical College ■ 大鼠SLCTa8基因的克隆及真核表达载体的构建 王本极 ,黄晓燕 ,林素 ,周希 ,戴晓春 ,方俊旭 ,杨德业 (1.温,Ji、J医学院附属第一医院 心内科,温州医学院心血管生物和基因研究所,浙江 温Ji、 325000 l2.温州医学院眼视光学院,浙江温州325000) ■ [摘要]目的:克隆大鼠左旋氨基酸转运体(SLC7a8)基因eDNA的读码框(CDS),构建携带SLC7a8基 因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR) 中的功能作准备。方法:从非高血压大鼠(wistar—kyoto,WKY)肾脏组织提取总RNA,通过RT.PCR得到总 cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM—T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表 达质粒peDNA3.1(+)。以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体pcDNA3.1(+)一SLC7a8用脂质体包裹 转染大鼠肾小管上皮细胞(NRK 52E),RT—PCR法及Western blotting法分别检测转染后SLC7a8 mRNA及 蛋白表达水平。结果:成功克隆了大鼠SLCTa8基因cDNA,重组真核表达载体pcDNA3.1(+)一SLCTa8构建 成功,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7a8 mRNA及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0.05)及空 质粒组(P<0.05)。结论:成功克隆了SLC7a8基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1(+).SLC7a8,能够 在NRK一52E细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨SLCTa8基因的生物学功能奠定了基础。 [关键词] 真核表达载体;SLC7a8;肾小管上皮细胞;基因;大鼠;克隆 [中图分类号]R544.1;Q78[文献标识码]A[文章编号]1000-2138(2011)06—0515—05 Cloning of rat SLCTa8 gene and construction of eukaryotic expression vector WANG Benji , HUANG Xiaoyan。LIN Su。ZHOU Xi。DAI Xiaochun,FANG Junxu YANG Deye. *Department of Cardiology,the First Affiliated Hospltal of Wenzhou MeScal college,Institute for Cardio- vascular Biology and Gene of Wenzhou Me cal College.Wenzhou.325000 Objective:To c1one rat SLC7a8 gene cDNA and construct its eukaryotic expression vector for its function study in SHR.Methods:Total RNA was extracted from rat kldney tiSSHe.SLC7a8 cDNA was prepared by RT-PCR,and inserted into pGEM—T Easy vector and confirmed by sequence analysis.Then the pGEM-T Easy vector which contained SLCTa8 cDNA was also amplified by PCR,and cloned into pcDNA3.1(+)plasmid.The recombinant plasmid was confirmed by PCR,double enzyme digestion analysis and DNA sequencing.Then the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)一SLC7a8 was transiently transfected into NRK・52E cells using Lipofectamln TM 2 000.The level of expression of SLC7a8 mRNA and protein was identified by RT—PCR and Western blotting after transfection.Results:The cDNA of SLC7a8 was cloned.and its recombinant eukaryotic expreSsion vector was constructed successfully. Over—expression of SLCTa8 mRNA and protein was observed in NRK-52E cells transfected with SLC7a8 gene as compared to the blank control cel1s and the cel1s transfected with an empty vector(both P<0.05). Conclusion:The pcDNA3.1(+)一SLC7a8 expression vector was successfully constructed and over— expression of SLC7a8 gene in NRK一52E cells was obtained.The recombinant eukaryotic expres. sion vector wi11 be used to investigate the biologic role of SLC7a8 in hypertensiOn. eukaryotic expression vector;SLC7a8;renal tubular epithelial cells;genes; rats:clone 原发性高血压(essential hypertension,EH) 是一种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的多 收稿日期:20l 1—05—30 基金项目:温州市科技发展计划基金资助项目(S20 0 2A1 32)。 基因遗传性疾病,是导致脑血管意外和冠状动脉疾 作者简介:王本极(1 9 8 6一),男,浙江苍南人,硕士生。 通讯作者:杨德业,教授,主任医师,博士生导师,Em a i l: deYeyang@126.com。 病的重要危险因素。近20年来的研究发现多巴胺及 其受体和影响其信号转导均和高血压密切相关l】_2】, 肾脏组织的肉分泌和旁分泌多巴胺对保持血压的动 一515— 第41卷 温州医学院学报 态平衡起着至关重要的作用。肾近端小管缺乏参与 多巴胺合成的酪氨酸羟化酶,但能重吸收循环滤过 取WKY大鼠肾脏组织总RNA,以此为模板,oligo—dT 为引物,RT—PCR合成cDNA。根据GeneBank中大鼠 SLCTa8序列设计引物,上游引物(F1):5’.GCTGTCA CTTTTAGAGCCTAGGAG-3’,下游引物(R1):5’一CAGGG ATACAGGGCAGAAAGGATGA一3’,用Prime STARTM HS DNA 的左旋多巴(L-DOPA),通过芳香族氨基酸脱羧而合 成多巴胺。研究发现SLCTa8(solute carrier fam- ily 7,member8)基因编码的蛋白为2型左旋氨基酸 转运体(type 2 L—type aminoacid transporter, Polymerase扩增SLC7a8编码序列,PCR反应条件 为:94。C预变性5 min;98。C变性10 S,57.8。C LAT2),是氨基酸转运体的轻链构成部分,决定了转 运体的性质,该转运体可调节肾小管顶端和基底侧 的L-DOPA摄取l。J。我们实验室采用自发性高血压大 鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)和 非高血压大鼠(wistar—kyoto,WKY)为动物模型, 用基因芯片技术初步筛选出新的高血压相关基因, 芯片发现SLCTa8基因的表达水平在SHR组中比WKY 退火15 S,72。C延伸2 min,循环35次,最后72 。C延伸5 min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳 分析。胶回收目的片段,以TAKARA公司的rTaqDNA polymerase在片段3’平末端后加上A尾,与pGEM— T Easy载体连接后,转化感受态细菌DH5 ,菌落 PCR快速鉴定,挑取数个阳性克隆抽提质粒,测序 鉴定。 组上调9.3倍|4I,为了进一步研究SLC7a8基因与高 血压形成、发展的关系,本实验室构建了携带该基 因的真核表达载体,为探讨SLC7a8在高血压形成发 展中的生物学功能作准备。 1材料和方法 i.i材料高保真DNA聚合酶Pr ime STARTM HS DNA 1.2.3重组载体的构建及鉴定:设计引物,上游引 牛勿(F2):5’- 垒垒 至GcTTTTGGTGGTcGGAAc CCTACGG一3’(划线部分依次是保护碱基,Hind 11酶 切位点)。下游引物(R2):5’.GGC GGTACCCAGGGA TAcAGGGcAGAAAGGATGA一3’(划线部分依次是保护碱 基,Kpn I酶切位点)。含SLC7a8基因CDS的cDNA 的pGEM—T Easy载体为模板,以“F2、R2”为引物、 Polymerase购自TAKARA公司;性内切酶均购 自NEB公司;pGEM.r Easy载体、T4连接酶购自 Promega公司;DH5 菌种,超级感受态细胞制备 试剂盒购自碧云天生物技术研究所;DMEM(high glucose)、FBS、0.05%胰酶/EDTA、Hanks balanced salt solution均购自Gibco;Trizol、Lipofeet. amineTM 2000转染试剂、DEPC水(RNase-free and DNase—free)均购自Invitrogen;RT试剂盒(Fever— taidTM first strand cDNA synthesis kit)、DNase 扩增SLCTa8编码序列,PCR反应条件为:94℃预 变性5 min;98。C变性10 S,56。C退火I5 S,72 ℃延伸2 min,循环3o次,最后72。C延伸5 min。 扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析。pcDNA3.1 (十)真核表达载体与PCR产物分别经Hind iii、Kpn I 双酶切。T4连接酶连接双酶切后产物(4℃,16 h) 后,转化DH5 感受态细菌,在含有氨苄西林抗性 LB平板上培养过夜,挑选菌落,提取质粒后,经 HindⅢ、Kpn I双酶切和PCR鉴定阳性克隆并测序 I(RNase—free 10 IU/L)购自Fermantas;West— ern blotting I ̄rabbit anti SLC7a8 polyclonal antibody购自AVIVA Systems Biology;Ⅱ抗goat polyclonal to rabbit IgG购自Abcam;WKY大鼠 肾脏组织、PCDNA3.1(+)载体由本实验室保存;质 粒抽提试剂盒均购自Omega公司;大鼠肾小管上皮 细胞(rat renal tubular epithelial cells一52e, 分析,得到阳性载体。测序由上海英骏生物技术有 限公司完成。 1.2.4脂质体转染:实验分空白对照组(BC组): 即未作任何处理;空质粒组(Nc组):转染1.2 g pcDNA 3.1(十)空载体组;实验组(P-SLC7a8组): 转染1.2 g重组载体pcDNA3.1(十)一SLC7a8。NRK一52E 细胞常规培养于含5%胎牛血清的DMEM(高糖)中。 转染前24 h收集细胞,以l×1O 孔的密度接种于 NRK一52E),购自中国科学院上海生命科学研究院细 胞资源中心。 1.2方法 6孔板中。待细胞生长达40%'---60%融合度时,用无 血清DMEM培养基清洗2次,按Lipofectamine 2 000 说明书进行转染。转染6 h后,换为含5%胎牛血清 的DMEM,在37。C的5%c0 培养箱继续培养48 h 后,进行下一步实验检测。 1.2.1 超级感受态细菌的制备:根据碧云天的超级 感受态制备试剂盒制备E.coli DH5 感受态,并测 定转化效率。 1.2.2 SLC7a8基因的cDNA克隆:用Trizol试剂提 第41卷 王本极,等:大鼠SLC7a8基因的克隆及真核表达载体的构建 第6期 毒载体相比,无免疫原性和潜在的不良反应,也不 会引起病毒播散。含有氨苄青霉素(ampici儿in) 和新霉素(neomycin)抗性基因,利于载体在大肠 起着重要作用,这与高血压的病理生理机制密切相 关。我们研究的目的就是试图寻找SLC7a8与高血压 之间的相关性,本研究中成功构建SLC7a8真核表达 载体,并成功转染NRK-52E细胞,这为我们进一步 探索SLC7a8基因的生物学功能、转基因研究及进一 步明确该基因与高血压的相关性奠定必要的基础。 杆菌中扩增和稳定表达的转染细胞筛选,而脂质体 介导的真核细胞转染能方便有效地将外源基因转入 靶细胞。 SLC7a8基因编码的蛋白为LAT2,LATI和LAT2 均属于SLC7家族。LAT2是氨基酸转运体的轻链构 成部分,而轻链(LAT2)在氨基酸转运过程中起重 要作用Is],该蛋白在体内主要表达在肾脏、肠、视 网膜上皮和牙蕾等组织_6】。目前研究发现rBAT和 参考文献: [1] Iimura O,Shimamoto K.Suppressed dopaminergic activity and water--sodium handling in the kidneys at the prehyper・- tensive stage of essential hypertension【J].J Auton Pharmacol,1990,10(Suppl 1):s73一s77. 【2] Albrecht FE,Drago J,Felder RA,et a1.Role of the D1A dopamine receptor in the pathogenesis of genetic hyper— LAT2调节肾小管顶端和基底侧左旋多巴的摄取[引, Soares da—Silva等It]在体外用肾LLC—PK1上皮细胞 为研究对象也发现左旋多巴主要通过非Na 依赖的 LAT2/4F2hc转运。肾脏内分泌和旁分泌多巴胺对保 tension[J].J Clin Invest,1996,97(10):2283-2288. 【3】 Quinones H,Collazo R,Moe OW.The dopamine precursor L—dihydrOxyphenylalanine is transported by the amino acid 持Na 的动态平衡起着至关重要的作用,左旋多巴 通过肾近端小管上皮细胞从肾小球滤过物和血浆中 ransportters rBAT and LAT2 in renal cortex【J】.Am J Physiol Renal Physiol,2004,287(1):F74一F80. 被摄取,为多巴胺的合成提供前体物质。低血液浓 度的多巴胺通过激动多巴胺受体起利钠扩血管从而 降压之作用,而较高血液浓度的多巴胺则主要通过 兴奋血管 受体,对全身血管(除冠状动脉外)均 产生强烈收缩反应,使血压升高。因此,血液中多巴 胺物质的增多,是导致高血压发生发展的重要机制 之一。 【4】 洪承吕,陈长曦,杨德业,等.新的高血压相关基因SLC7A8的 实验研究『J].中国病理生理杂志,2007,23(1 1):2122—2125. 【5】 Broer A,Friedrich B,Wagner CA,et 1.Associataion of 4F2hc with light chains LAT1.LAT2 or y+LAT2 requires different domains[J].Biochem J,2001,355(Pt3):725—731. 【6】 Bassi MT,Sperandeo MP,Incerti B,et a1.SLC7a8,a gene mapping within the lysinuric protein intolerance critical region,encodes a new member of the glycoprotein—associ— Pinho等[81以SHR和WKY为实验对象,比较两者 肾皮质LAT2的表达及左旋多巴的摄取情况,结果发 现4~12周时,SHR对左旋多巴的摄取明显多于 WKY,RNA印迹发现肾脏中LAT2的表达SHR高于WKY, ated amino acid transporter family[J].Genomics,1999,62 (2):297—303. [7] Soares・da—Silva P,Serrao MP.High—and low—afinifty trans— port of L--leucine and L・-DOPA by the hetero amino acid exchangers LAT1 and LAT2 in LLC-PK1 renal cells【J】.Am J Physiol Renal Physiol,2004,287(2):F252一F261. [8]Pinho MJ,Gomes P,Serrao MP,et a1.Organ—specific over— expression of renal LAT2 and enhanced tubular L—DOPA 且4周时比12周时更明显。这结果提示SHR的肾脏 过度LAT2可以增加L-DOPA的摄取,这种表现是器 官特异性的,而且预示着血压增高。在WKY和SHR的 肾近球小管上皮中,左旋多巴的摄取在WKY几乎全部 uptake precede the onset of hypertension[J].Hypertension, 2003,42:613-618. 通过LAT2,而SHR 25%通过LAT2、25%通过钠通道 【9】Pinho MJ,Serrao MP,Gomes P,et a1.Over—expression of renal LAT 1 and LAT2 and enhanced L—DOPA uptake in 依赖的转运系统B(0)、50%通过LAT1,且LAT1和 LAT2蛋白在SHR中明显上调l 9l。Pinho等[101最新的研 SHR immortalized renal proximal tubular cells【J】.Kidney Int,2004,66(1):216—226. 【1 0]Pinho MJ,Serrao MP,Soares—da—Silva P.High—salt intake and the renal expression of amino acid transporters in spon— 究发现,肾多巴胺系统与非钠依赖(LAT1、LAT2)氨 基酸转运体基因转录以及肾小管摄取L—DOPA有着密 切的联系。我们实验室采用SHR和WKY为动物模型, 用基因芯片技术初步筛选出新的高血压相关基因, 芯片发现19个基因在SHR中上调,其中SLCTa8基 因的表达水平在SHR组中比WKY组上调9.3倍[4]。 综上,SLC7a8在肾脏组织左旋多巴的摄取 taneously hypertensive rats[J].Am J Physiol Renal Physiol, 2007,292(5):F1452一F1463. (本文编辑:吴健敏) 一519一