国际检验医学杂志２０１３年３月第３４卷第６期Ｉｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｍａｒｃｈ ２０１３，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．６ ・ ７Ｏ７ ・ ＮＡＬＣ—ＮａＯＨ前处理法具有耐受性。 ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｕｒｙ［Ｊ］．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ），２００９，８８（４）：２５０ ２６１． 综上所述，当痰液等被杂菌污染的标本直接接种在非选择 性培养基上时，由于其中常常会有大量的正常菌群等，致使不 易检出可能存在的诺卡菌 ］。因此，对于可疑为肺诺卡菌病 的患者，若能将痰标本经ＮＡＬＣ—ＮａＯＨ法消化处理后再接 种Ｄｏ］，将有利于诺卡菌的检出。 参考文献 ［１］ Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｒ，Ｒｅｙｅｓ Ｓ，Ｍｅｎ６ｎｄｅｚ Ｒ．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｎｏｃａｒｄｉｏｓｉｓ：ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｕｌｍ Ｍｅｄ，２００８，１４（３）：２１９－２２７． ［５］中国防痨协会基础专业委员会编著．结核病诊断实验室检验规程 ［Ｍ］．北京：中国教育文化出版社，２００６：３０—３５． ［６］俞树荣．微生物学和微生物学检验［Ｍ］．２版，北京：人民卫生出版 社，２００２：２７１． ［７］王敬萍，李宝兰，刘涌，等．原发性奴卡氏菌病ｌ例［Ｊ］．中国防痨 通讯，２００４，２６（２）：１２８． ［８］Ｍｕｒｒａｙ ＰＲ，Ｎｉｌｅｓ ＡＣ，Ｈｅｅｒｅｎ ＲＬ．Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｈａｙｅｒ－Ｍａｒｔｉｎ ｍｅｄｉ ｕｍ ｆｏｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８８，２６（６）：１２１９－１２２０． ［９］吴立平，杨艺，刘婷．肺诺卡菌病１例［Ｊ］．中国抗感染化疗杂志， ２００５。５（２）：１１７－１１８． ［２］Ｇｕｐｔａ Ｅ，Ｄｈａｗａｎ Ｂ，Ｔｈａｂａｈ ＭＭ．Ｎｏｃａｒｄｉａ ｐｙｏｐｎｅｕｍｏｔｈｏｒａｘ ｉｎ ［１０２李术惠．Ｎ一乙酰一Ｌ一半胱氨酸ＮａＯＨ法前处理痰标本检出星形诺 ａｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｐａｔｉｅｎｔ［Ｊ］．Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ，２００６，１２４（３）： ３６３ ３６４． 卡菌１例［Ｊ］．临床检验杂志，２ｏ¨，２９（５）：３６０． （收稿日期：２０１２－１ｌ＿０９） ［３］张卓然，倪语星．临床微生物学和微生物检验［Ｍ］．３版，北京：人 民卫生出版社，２００３：２２９—２３０． ［４］Ｍｉｎｅｒｏ ＭＶ，Ｍａｒｉｎ Ｍ，Ｃｅｒｃｅｎａｄｏ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｃａｒｄｉｏｓｉｓ ａｔ ｔｈｅ ｔｕｒｎ ・检验技术与方法・ 单纯疱疹病毒核酸分型诊断方法的建立 支丽霞 ，赵云生 ，江秀娟。 （１．兰州市第二人民医院检验科，甘肃兰州７３００４６；２．甘肃省定西市红十字会中心血站， 甘肃定西７４３０００；３甘肃省肿瘤医院检验科，甘肃兰州７３００５０） 摘 要：目的 应用荧光定量聚合酶链式反应（ＦＱ ＰＣＲ）技术，建立一种快速、灵敏度高、特异性强且可以定量分型检测单纯 疱疹病毒（ＨＳＶ）的方法。方法根据单纯疱疹病毒糖蛋白Ｂ基因序列设计引物和探针，建立ＨＳＶ１、２型检测的方法；构建标准 品进行定量分析，测试方法的灵敏度；检测相关的其它临床分离菌株和样本，测试方法的特异性。结果 检测ＨＳＶ１、２的自建标 准品，检测下限分别可以到达３００ ｃｏｐｙ／ｍＬ和４００ ｃｏｐｙ／ｍＩ ，且标准曲线的相关系数均大于０．９９８。通过检测参考菌株和临床标 本，证明具有１００ 的特异度；且可以对ＨＳＶ１、２分型。结论的临床使用价值。 本方法是一种快速、灵敏且准确的ＨＳＶ分型检测方法，具有重要 关键词：单纯疱疹病毒属；核酸分型；ＰＣＲ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１３．０６．０３４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３ ４ｌ３Ｏ（２Ｏ１３）０６—０７０７—０２ 单纯疱疹病毒（ＨｓＶ）是人类病毒性疾病中常见的病原体 之一，根据抗原性不同，可分为ＨＳＶ１和ＨＳＶ２两种血清型。 两种血清型的临床表现不同，ＨＳＶ１主要引起腰部以上，如眼、 均由兰州市第二人民医院检验科提供。 １．２试剂与仪器 ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ和ａｒｔｕｓ ＨＳＶ一１／２ ＰＣＲ Ｋｉｔ ＣＥ（德国Ｑｉａｇｅｎ公司产品）；ｐＭＤ１８－Ｔ载体（ＴＡＫＡ— ＲＡ公司产品）；Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ纯化试剂盒 （Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品）；ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 口、唇的皮肤黏膜以及中枢神经系统的感染，ＨＳＶ２主要引起 生殖器部位的皮肤黏膜及新生儿感染，并与女性外阴癌和宫颈 癌的发生有关。ＨＳＶ两种亚型感染的预后和处理方法不同， 因此对ＨＳＶ感染进行早期诊断和分型具有重要的临床意义 （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司产品）；ＤＵ７３０核酸蛋白分析仪（贝 克曼公司产品）；ＡＢＩ９７００ＰＣＲ扩增仪及ＡＢＩ７５００荧光定量 ＰＣＲ仪（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司产品）。 １．３方法 和流行病学意义＿】 ３＿。目前对单纯疱疹病毒性疾病的实验室诊 断主要以免疫学方法为主，检测的灵敏度和准确度不够理想。 而荧光定量ＰＣＲ技术是目前较先进的分子生物学技术，具有 特异性强、灵敏度高且稳定性好等优点，另外荧光ＰＣＲ仪可以 同时检测５种不同波长的荧光信号，可用于ＨＳＶ的核酸分型 鉴定 。］。本研究拟利用多色实时荧光定量ＰＣＲ技术在同一 １．３．１引物与探针设计根据ＧｅｎＢａｎｋ中提供的ＨＳＶ糖蛋 白Ｂ基因序列分别设计特异性检测ＨＳＶ１和ＨＳＶ２的引物和 探针。以ＨＳＶ１的糖蛋白Ｂ基因（序列号：ＡＦ３１１７４０．１）和 ＨＳＶ２的糖蛋白Ｂ基因（序列号：ＡＦ２９５５２８）为模板，使用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０软件设计引物和探针。最后将设计好的引 反应体系中建立一种对ＨＳＶ１和ＨＳＶ２型核酸分型准确、特 异、简便的鉴别诊断方法。 １材料与方法 物和探针序列在ＮＣＢＩ数据库中进行Ｂｌａｓｔ比对，确定ＨＳＶ１ 或ＨＳＶ２引物和探针的保守性。ＨＳＶ１：上游引物ＨＳ１一Ｆ为 ５，＿ＡＡＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＴＧ一３ ，下游引物ＨＳ１一Ｒ 为５．＿ＴＣＡ ＣＣＧ ＴＣＴ ＴＴＧ ＴＴＧ ＧＧＡ ＡＣＴ一３ ，探针ＨＳ１～Ｐ 为５ 一ＦＡＭ—ＡＡＧ ＣＧＣ ＣＧＣ ＡＲ（Ｒ—Ａ／Ｇ）ＣＡＣ ＣＡＡ ＣＴＡ ＣＡＣ Ｃ—ＢＨＱ１—３ ；ＨＳＶ２：上游引物ＨＳ２一Ｆ为５ 一ＡＣＧ ＧＡＡ ＣＡＣ ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＧＡ ＡＡ一３ ，下游引物ＨＳ２一Ｒ为５，＿ＡＧＣ １．１ 菌株与临床标本 标准菌株单纯疱疹病毒ｌ型ＡＴＣＣ ＶＲ一１４９３和单纯疱疹病毒２型ＡＴＣＣ ＶＲ－５４０购自美国 ＡＴＣＣ公司。实验室分离菌株单纯疱疹病毒１型（４株）、单纯 疱疹病毒２型（１０株）、淋球菌（３株）、沙眼衣原体（２株）、解脲 脲原体（２株）、白色念珠菌（１株）、巨细胞病毒（１株）、人乳头 瘤病毒阳性标本（ＨＰＶ ６、ｌ１、ｌ６和１８型各２例）、杜克雷氏杆 菌（１株）、阴道毛滴虫阳性标本（２株）和６ｏ例生殖器疱疹标本 ＧＧＡ ＧＡＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＣＴ ＴＴＧ一３ ，探针ＨＳ２一Ｐ：５ ＨＥＸ— ＣＡＡ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＣＧ Ｃ—ＢＨＱ１—３ 。引物和探 ・ ７Ｏ８ ・ 国际检验医学杂志２０１３年３月第３４卷第６期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｍａｒｃｈ ２０１３，Ｖ０１．３４，Ｎｏ．６ 针由宝生物工程（大连）有限公司合成。 １．３．２ ＤＮＡ提取菌株直接取２００ Ｌ培养物用于ＤＮＡ提 取；Ｉ临床标本处理方法为：往样本收集管中加入２ ｍＬ无菌生 理盐水，充分震荡洗涤棉拭子，然后将拭子靠管壁挤于丢弃，取 ２００ ｔＡ 液体用于ＤＮＡ提取。所有菌株和临床标本均采用 ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ按照产品说明书提取ＤＮＡ。 １．３．３标准品的构建ＨＳＶ１和ＨＳＶ２标准株扩增的ＰＣＲ 产物分别连接到ｐＭＤ１８一Ｔ载体上，测序正确的质粒分别作为 ＨＳＶ１和ＨｓＶ２的标准品。构建成功的载体使用ＤＮＡ纯化 试剂盒进行纯化后，再采用ＤＵ７３０核酸蛋白分析仪测定质粒 的浓度，换算成拷贝数后，作为阳性标准品制作标准曲线。 Ｉ．３．４ 反应体系的优化 反应体系的优化是在ＴａｑＭａｎ通用 ＰＣＲ反应体系基础上进行的，所有引物终浓度选择０．２￣ｍｏｌ／ Ｉ 至０．４／￣ｍｏｌ／Ｉ 范围内优化，所有探针终浓度选择０．１／￣ｍｏｌ／ Ｉ 至０．３“ｍｏｌ／Ｉ 范围内优化。ＨＳＶ１和ＨＳＶ２模板使用构建 的质粒标准品，包括ＨＳＶ１和ＨＳＶ２独立的和混合的两种类 型的模板，浓度选择１００ ０００拷贝 反应体系和１ ０００拷贝／反 应体系两个梯度。 １．３．５ 反应条件的选择 本研究采用两步法进行反应条件的 优化，其中主要是优化延伸加退火步骤的温度和时间，有３种 组合供选择：６０ Ｃ，５０ ｓ；５８ Ｃ，６０ ｓ和６Ｏ℃，６０ ｓ。 ２ 结 果 ２．１最佳反应体系建立最终确定的反应体系中各成分的终 浓度为：ＨＳ１一Ｆ和ＨＳ１一Ｒ各０．３ ｔｌｍｏｌ／Ｉ ，ＨＳ２ Ｆ和ＨＳ２一Ｒ各 ０．２ ｔｏｏｌ／Ｌ，ＨＳ１一Ｐ为０．１ ｍｏｌ／Ｉ ，ＨＳ２一Ｐ为０．２ ｍｏｌ／Ｌ。最 终确定的反应条件为：９４℃，预变性１０ ｍｉｎＭ５个循环包括：９４ ℃，ｌ５ ｓ和６０℃，５０ ｓ。 ２．２ 特异性 本试剂检测单纯疱疹病毒１型ＡＴＣＣ ＶＲ＿ １４９３、单纯疱疹病毒２型ＡＴＣＣ ＶＲ一５４０、单纯疱疹病毒ｌ型（４ 株）和单纯疱疹病毒２型（１０株）均为阳性，且可以对两者分 型；参考菌株淋球菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、白色念珠菌、巨 细胞病毒、人乳头瘤病毒阳性标本、杜克雷氏杆菌、阴道毛滴虫 阳性标本均为阴性。说明引物和探针的特异性好。 ２．３ 灵敏度及标准曲线ＨＳＶ１的质粒标准品从３ ０００ ０００ 拷贝／ｍＩ 按１０倍梯度稀释至３００ ｃｏｐｙ／ｍＩ ，均可以检出； ＨＳＶ２的质粒标准品从４ ０００ ０００ ｃｏｐｙ／ｍＬ按ｌｏ倍梯度稀释 至４００ ｃｏｐｙ／ｍＩ ，均可以检出；而且ＨＳＶ１和ＨＳＶ２同一梯度 的模板在同…管中进行扩增的。该方法对ＨＳＶ１的检测范围 在３０ ０００ ｃｏｐｙ／ｍＩ 到３００ ｃｏｐｙ／ｍＩ 之间，且灵敏度达到３拷 贝 反应体系；该方法对ＨＳＶ２的检测范围在４０ ０００ ｃｏｐｙ／ｍＬ 到４００ ｃｏｐｙ／ｍＩ 之间，且灵敏度达到４拷贝／反应体系；相互间 影响彼此的扩增。选择ＨＳＶ１的５个浓度梯度的模板制作 的标准曲线，相关系数ｒ 为０．９９８ ９；选择ＨＳＶ２的４个浓度 梯度的模板制作的标准曲线，相关系数ｒ 为０．９９８ １；说明该 方法对ＨＳＶ１和ＨＳＶ２定量检测的标准曲线的线性较好。 ＨＳＶ１的标准曲线的斜率为一３．９８，ＨＳＶ２的标准曲线的斜率 为一４．Ｏ８，斜率接近，说明两者的扩增效率基本一致。 ２．４ ６０例临床样本的测试 对６Ｏ例生殖器疱疹临床标本同 时使用本试剂和ａｒｔｕｓ ＨＳＶ １／２ ＰＣＲ Ｋｉｔ ＣＥ（德国ＱＩＡＧＥＮ 公司产品）进行检测，对比检测结果表明两种试剂的阳性符合 率为１００ ，两种试剂的阴性符合率也为１００７ｏ，所以，两种试 剂检测结果完全相符合。６ｏ例样本中，ＨＳＶ阴性的标本９例 （占１ ５ ），ＨＳＶ１阳性的３例（占５ ），ＨＳＶ２阳性的８Ｏ ，未 检测到ＨＳＶ１和ＨＳＶ２同时感染的样本。对３例ＨＳＶ１阳性 的ＰＣＲ产物和随机抽取了１Ｏ例ＨＳＶ２阳性的ＰＣＲ产物送往 ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ上海公司进行测序，测序结果和ＧｅｎＢａｎｋ中ＨＳＶ 相关序列同源性大于９９ ，证明检测结果正确。 ３讨 论 病毒细胞分离培养是实验室诊断ＨＳＶ感染最为敏感的 方法，且可以对分离株分型鉴定，但该方法对实验条件要求严 格，且成本高、操作繁琐、实验周期长，在临床应用有很大的局 限性，不易开展。ＨＳＶ的血清学试验主要检测存在于血清中 的ＨＳＶ抗原或特异性抗体，常用方法为ＥＩ ＩＳＡ、间接免疫荧 光法和胶体金方法等。ＥＩ ＩｓＡ检测ＨＳＶ抗原具有方便、快 速、特异性较强等特点，对疱疹皮损的ＨＳＶ抗原检出率较高， 但疱疹后期皮损的ＨｓＶ抗原检出率较低。而血清ＨＳＶ特异 性ＩｇＭ和ＩｇＧ抗体需要在感染后一定的时间产生，有可能出 现假阳性或假阴性，同时ＨＳＶ感染所造成的临床症状各有 同，可能会产生误诊和误治 。ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ检测单纯疱疹 病毒，两方法特异性完全一致，ＰＣＲ检测阳性率高，比Ｅ１ ＩＳＡ 敏感近２ｏ倍 】。目前，国家食品药品监督管理局批准上市的 单纯疱疹病毒荧光ＰＣＲ检测试剂盒有７个，其中检测ＨＳＶ１ 的有１个，检测ＨＳＶ２的有６个，但未有ＨＳＶ１、２同时检测或 分型检测的荧光ＰＣＲ试剂盒得到批准上市，现有研究对 ＨＳＶ１、２的ＰＣＲ分型检测方法大多在２个反应管中进行，本 研究在同一反应管中利用多色荧光定量ＰＣＲ技术建立的 ＨＳＶ１和ＨＳＶ２核酸分型诊断方法使实验操作更为简便。通 过检测标准菌株和临床标本，具有１００ 的特异度；通过检测 ＨＳＶ１和ＨｓＶ２的自建标准品，灵敏度分别可以到达３００ ｃｏｐ ｙ／ｍＬ和４００ ｃｏｐｙ／ｍＬ，且标准曲线的相关系数均大于０．９９８； 整个实验过程在１个半小时内完成，不但可以对ＨＳＶ定量，而 且可以对ＨＳＶｌ和ＨＳＶ２分型，是一种快速、灵敏且准确的 ＨｓＶ分型检测方法，具有重要的临床使用价值。 参考文献 ［１］姬小薇，毛旭虎，邹全明．单纯疱疹病毒型特异性的鉴别诊断［Ｊ］． 国际检验医学杂志，２００６，２７（８）：７３９ ７４０． ［２］赖迪辉，朱威，连石．单纯疱疹病毒实验室检测方法的研究进展 ＥＪ］．中国计划生育学杂志，２ｏｌＯ，１８（６）：３８０—３８１． Ｅ３］Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃｏｓｔｅｌｌｏ ＭＴ，Ｓａｂａｔｉｎｉ Ｉ ．Ｙｕｎｇｂｌｕｔｈ Ｉ ．Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｎｅｗｓｌ，２００６，２８（２４）：１８５ １９２． ［４］Ｐａｎｄｏｒｉ Ｍｗ，Ｉ ｅｉ Ｊ，Ｗｏｎｇ ＥＨ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００６，６（６）：１Ｏ４． Ｅｓ］陈淑云，采云，陈激扬．不同实时荧光定量聚合酶链反应技术研究 进展ＥＪ］．国际检验医学杂志，２０１２，３３（５）：５５８ ５６０． ［６］王晓莉，江秀娟．荧光定量聚合酶链反应在淋球菌检测中的应用 评价［Ｊ］．国际检验医学杂志，２０１２，３３（１Ｏ）：１２３８ １２４０． ［７］赵友云，周立，高应林，等．实时荧光定量ＰＣＲ鉴别检测单纯疱疹 病毒方法的建立［Ｊ］．武汉大学学报：医学版，２００８，２９（５）：６１７ ６１９． ［８］徐安健，赵高潮，乌姗娜，等．单纯疱疹病毒血清学检测及其临床 应用进展［Ｊ］．国际医学寄生虫病杂志，２０１０，３７（６）：３８１ ３８３． ［９］Ｂｉｎｎｉｅｋｅｒ ＫＬ，Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ ＤＪ，Ｈａｔｔｉｎｇ ＪＡ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍｕｌ— ｔｉｐｌｅｘ ｆｌｏｗ ｉｍｎｍｎｏａｓｓａｙｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ ｃｌａｓｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｅｒ ｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ １ ａｎｄ ２［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ ｌｍｍｕｎｏｌ，２Ｏ１ ０， １７（２）：２５３ ２５７． ［１０；唐家琪，陶开华．ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ检测单纯疱疹病毒的比较［Ｊ］．中 华微生物学和免疫学杂志，１９９３，１３（５） ３２９ ３３１． （收稿日期：２Ｏ１２ Ｏ９（３９）