专论与综述 疯牛病的检测技术的研究进展 闫梦菲 ，邢海权 （１．南京农业大学动物科技学院，南京２１００９５；２．山西农业大学动物科技学院，太谷０３０８０１） 摘要：疯牛病（ｍａｄ ＣＯＷ ｄｉｓｅａｓｅ）又叫牛海绵状脑疾病（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ＢＳＥ）， 是１９８５年突然在英国出现的侵害成年牛中枢神经系统的一种致死性疾病，属人畜共患传染病。它 引起牛脑海绵状病变，使牛大脑功能退化，导致牛精神错乱、痴呆和死亡。牛总是吃了那些羊制品 饲料感染而发病，这些羊患有绵羊疯痒病。疯牛病潜伏期较长，一般４～６年。牛感染此病后，起初 无明显症状，只是体重减轻，精神不好，产奶量下降，发病后烦躁不安、恐惧，具有攻击性，共济失 调，肌肉震颤，一般在牛发病后０．５个月至６个月死亡。 关键词：疯牛病：检测技术：ＥＬＩＳＡ；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ＤｏＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－６０２７．２０１ １．０６．００６ 疯牛病又叫牛海绵状脑疾病（ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｅｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ＢＳＥ），是１９８５年突然在英国出现的 侵害成年牛中枢神经系统的一种致死性疾病，属人 畜共患传染病。它引起牛脑海绵状病变，使牛大脑 功能退化。导致牛精神错乱、痴呆和死亡。牛感染此 备特异性抗体，从而实现活体蛋白质分子的检测。 目前，较为有效的ＢＳＥ检测方法是基于抗原一抗体 反应的免疫学方法和毛细管电泳及由此衍生的酶 联标记、荧光扫描等方法。 １ 病原与致病机理 疾后，起初无明显症状，只是体重减轻，精神不好， 产奶量下降，发病后烦躁不安、恐惧，具有攻击性， 共济失调，肌肉震颤，一般在牛发病后０．５个月至６ 个月死亡。 １．１朊蛋白的构象畸变学说 ２０世纪中叶，人们在研究羊瘙痒病时发现，其 致病因子对几乎所有微生物（包括病毒）的灭活手段 都具有一定的抗性。如可抵抗蛋白酶的降解及核酸 ＰＲＰｓＣＢＳＥ的致病因子，是机体内普遍存在的 一的处理方法等，而且能通过阻止已知最小病毒的滤 器，在宿主动物体内不引起炎症反应。之后，牛因食 用了含有此种致病因子的羊肉骨粉的饲料而受到 了感染，从而导致了所谓的疯牛病。基于大量的实 验研究，对疯牛病的致病原因，科学家们提出了种 种假说，但大多数学者赞同美国加州大学Ｐｒｕｓｉｎ教 种不含核酸的蛋白质病毒，宿主对其无免疫反 应，感染动物的血清中无抗体产生，因而，用常规的 血清学方法无法检测，也不能用像鉴定病毒和细菌 等常用的微生物分离培养的方法及基于核酸杂交 的方法进行检测，而最初用于ＢＳＥ检测的病理学方 法也只能用于发病后期及死后的检测。近几年，人 们采用其它对朊病毒有敏感免疫反应的动物来制 授提出的朊蛋白学说。该学说认为疯牛病是由生物 体内的一种正常蛋白发生构象畸变而引起的，把这 管分泌，并同时注射１／３量的８４６合剂加等量的氯 丙嗪以保定动物。 根据资料，符合雾化吸人条件的抗菌药物较 常选用地塞米松，主要考虑的是防止药物过敏反 应，而不是它的抗炎作用。 使用皮质类固醇雾化吸入给药后，要注意清洗动 物面部和口腔，防止接触药物的局部发生真菌感染。 雾化吸人给药在治疗呼吸道疾病中是重要的 多，但实际临床上应用的不多。氨基苷类应用较多， 可能是该类药物呼吸道局部吸收很少，能够在局部 形成较高浓度并维持较长时间，杀菌作用更好。 辅助疗法，动物全身给药仍然是主要的治疗方法， 这一点一定要明确，不可本末倒置。 （参考文献从略） 根据药物学资料，似乎并不推荐地塞米松磷酸 钠作为雾化吸入给药的药物选择。但与部分资料介 绍的那样，笔者在混合多种药物雾化吸入给药时常 ・● ● ２ｏ”年第６期◇ 种蛋白称为朊病毒蛋白，简称朊蛋白，其正常构象 转变为异常构象是引发该类疾病的主要原因引。异 常构象的朊蛋白通过消化道经淋巴、外周神经最后 定位到脑部，以指数增长的方式催化朊蛋白发生构 学特性的重要实验。缺点是费时、费力，滴定误差 大，需消耗大量动物，且费用昂贵。 ２．３组织病理学方法 是对ＢＳＥ感染的脑超薄切片进行电子显微镜 象改变，变构后的异常朊蛋白在脑部大量凝集沉 淀。逐渐地在脑细胞中形成星形胶质细胞和微小胶 观察，从而确诊ＢＳＥ疾病的一种方法。但这种检查 一般是在疾病发展的后期进行，难以实现ＢＳＥ的活 质细胞，使脑组织海绵体化，空泡化，甚至产生淀粉 样斑等。从而引起脑部神经功能紊乱，致使机体患 体检测。 ２．４免疫学方法 病，又因此种蛋白构象的改变在自然条件下是不可 逆的，最终导致动物死亡。 １．２病原特点 朊蛋／￣１（ＰｒＰ）主要分布于动物神经元细胞表面， 是机体正常表达的一种糖蛋白ｆ在脑、脾、肠、唾液 腺、胎盘及所有神经元、淋巴细胞、单核细胞和血小 板等均可找到），由单拷贝染色体基因的单一外显子 所编码。朊蛋白基因广泛存在于哺乳动物细胞，人 类、小鼠和牛编码的ＰｒＰ基因分别位于第２０、２和 ｌ３号染色体上。ＰｒＰ是组成型基因表达产物，分为 ＰｄＰｃ和ＰｒＰｓｃ两种。Ｐ是以 螺旋为主的正常构象 的朊病毒。 ２朊病毒的检测方法 ＰＲＰｓＣ ＢＳＥ的致病因子，是机体内普遍存在的 一种不含核酸的蛋白质病毒，宿主对其无免疫反 应，感染动物的血清中无抗体产生，因而，用常规的 血清学方法无法检测，也不能用像鉴定病毒和细菌 等常用的微生物分离培养的方法及基于核酸杂交 的方法进行检测，而最初用于ＢＳＥ检测的病理学方 法也只能用于发病后期及死后的检测。近几年，人 们采用其它对朊病毒有敏感免疫反应的动物来制 备特异性抗体，从而实现活体的ＰｒＰｓｃ蛋白质分子 的检测。目前，较为有效的ＢＳＥ检测方法是基于抗 原一抗体反应的免疫学方法和毛细管电泳及由此 衍生的酶联标记、荧光扫描等方法。 ２。１病理学方法 病理组织解剖及动物传递传染实验多用于发 病后期及死后诊断，用任何新方法做出的阳性结果 均需用此方法作以最终判定。 ２．２生物学方法 主要是通过动物传递实验来判断生物体是否 感染朊病毒及测定感染滴度。接种动物后，取即将 死亡时的脑组织作病理学检查，以验证朊病毒感 染。该方法的优点是比较敏感，是研究朊病毒生物 ＜ｎ １２ ２０１３年第６期 虽然ＰｒＰｓｃ对牛ｆ羊）无免疫反应，但却可用它 作为抗原来免疫其它动物获得特异性抗体，即抗 ＰｒＰ抗体，进而应用免疫学方法来检测朊病毒病。抗 原的获得除了从患病组织中直接提取外，还可通过 基因工程等方法人工合成ＰｒＰ肽抗原，这样既免除 了抗原来源不足的缺陷，又提高了操作过程的安全 性。抗体的产生多是用完整的ＰｒＰ蛋白免疫ＰｒＰ基 因缺失小鼠，或用重组的ＰｒＰ肽段与其他蛋白融合 后，加佐剂免疫小鼠，接着利用传统的杂交瘤技术 或噬菌体表面展示技术筛选出特异性较高的抗体。 目前，用牛ＰｒＰｃ蛋白为抗原免疫ＰｒＰ基因缺陷小 鼠，已成功地筛选出了能与牛、人及鼠的Ｐ特异结 合的单抗１５Ｂ３，并已经获得了多种能与Ｐｒ】 结合 的单抗。 ２．５免疫印迹检测 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验是目前国际上用于确诊疯牛 病的方法之一，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验是检测蛋白质的 一种免疫印迹法。根据朊病毒病理论假设，ＴＥＳｓ病 原是宿主基因编码的一种蛋白质ｆＰｒＰｃ）的异构体 （ＰｒＰｓｃ）。这种异常的蛋白质沉积在脑组织中，就会引 起人和动物发病。由于在ＢＳＥ或其他传染性脑病中 检测不到免疫反应，因而无法使用血清学试验。但 ＰｒＰｓｃ具有部分抵抗蛋白酶Ｋ ｆＰＫ）消化的能力，而 ＰｒＰｃ却可被ＰＫ完全消化。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法就是利 用ＰｒＰｓｃ的这一特Ｉ生对其进行检测的。该试验１９９８ 年第一次作为瑞士官方认可的检测疯牛病的方法， １９９９年欧盟委员会对该方法进行了评估，认为其特 异性和敏感性都是１００％。溶解的牛脑组织也可以 用此试验进行疯牛病检测。该试验还可以检测出患 疯牛病但脑组织还没有出现病理变化的牛。对于动 物朊病毒病的诊断还有许多方法如临床检查ｆ对可 见症状的分析）、免疫细胞化学法０ｃｃ）、ＥＬＩＳＡ检查 方法、组织学检查ｆｊ匿过脑组织切片检查脑组织病理 性的变化）、电镜下痒病相关纤维（ＳＡＤ的检查、感染 ・・ａ翟 蚕圜・簟 专论与综述 性的生物学试验。对于疯牛病来讲，临床症状和组 织学检查不能作为特异的的诊断方法，只能作为一 否含有牛肉的ＥＬＩＳＡ方法，该法不受乳制品、肠衣、 明胶和调味品的影响。Ｗｉｊｎｇａｕｒｄｓ ｆ ２００１１指出 种辅助诊断材料。ＳＡＦ的电镜检查是比较准确的一 种诊断手段，但由于检测技术复杂、要求设备费用 昂贵，不宜作为日常检测的方法推广使用。感染性 的生物学试验，需时太长，只能在研究中应用。免疫 细胞化学法是一种特异性和敏感性均为１００％的疯 牛病诊断方法，但这种方法至少需要数天时间，所以 不适宜用于大规模的普查，但它是目前确诊疯牛病 的敏感的方法。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验只需要几个小时， 所以可用于大规模的疯牛病检测中。 以抗体Ｔ１对经蛋白酶Ｋ消化的脑组织提取物 进行免疫反应，根据消化后的样品中是否含有抗蛋 白酶Ｋ的Ｐ存在及其分子量的大小，就可以检测机 体是否被ＢＳＥ所感染。此方法除了可以鉴定标本中 特定的组分外，还可显示电泳分离图谱，应用价值 较高。该技术简便、快速，而且不受组织自溶的影 响，能在组织病理学结果阴性或含糊的情况下检出 ＰｒＰ具有早期确诊价值，目前，已成为朊病毒研究中 最常用的检测方法之一。类似的免疫检测方法还有 组织印迹和斑点印迹。组织印迹的是将冰冻的切片 转移到纤维素膜上。直接进行免疫反应。斑点 印迹则是取组织匀浆离心后的上清液和含ＳＤＳ样 本缓冲液的混合液，点样于纤维素膜上，用蛋 白酶Ｋ消化后，再进行免疫检测。后两种方法不如 免疫印迹法准确、可靠，但其操作相对简便，对仪器 要求低，适合大量标本的检测。 ２．６酶联免疫吸附实验（ＥＬＩＳＡ）酶免疫测定是２０ 世纪７０年代发展起来的一项新的免疫学技术，它 将酶促反应的高效率和免疫反应的高效专一性有 机的结合起来，可对各种微量有机物进行测定，具 有灵敏度高、特异性强、方便快速、对仪器设备要求 不高的优点。此法是在Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ基础上建立的。 进行检测时，将ＰｒＰＳＣ吸附于塑料表面，用硫氰酸 胍变性后，可使其表位充分暴露，免疫反应性增强。 而后加入酶标记的抗体，与ＰｒＰＳＣ形成复合物，最 后加人显色剂，通过颜色的深浅判断阴阳性，以此 原理建立的ＥＬＩＳＡ方法可检测ＰｒＰＳＣ，其灵敏度并 不亚于ＷＢ，该法具有快速和适合于大量标本筛选 的特点。目前，它已广泛应用于医学、生物学等领域 Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ（２００１）建立了检测生肉或熟肉制品中是 ・● ●・ ＥＬＩＳＡ在检测肉制品中肉的组成时结果通常很可 靠，但是由于抗血清和其它动物的蛋白质或非动物 蛋白成分发生交叉反应，可能会出现假阳性结果， 这时就需要借助其它方法（如ＤＮＡ检测）来确证。 该技术是依据抗原一抗体特异性反应和酶高效催 化作用相结合的一种免疫标记技术。根据研究方法 不同可将检测朊病毒的ＥＬＩＳＡ方法分为间接酶免 疫测定法、双抗体夹心法和酶标抗原竞争法。该方 法与其它方法相比具有灵敏度高、特异和重复性都 很好，且无放射污染，可定量测定和自动化等优点， 非常适合大批量ＢＳＥ标本的普查筛选工作。 最近报道。Ｖｏｉｄ等根据酶联夹心免疫原理，用经 过特别处理的细菌表层细胞结晶来检测ＢＳＥ，该方 法简便、快捷，灵敏度高，是免疫学检测的又一突破。 ２．７仪器检测法 主要是对Ｐ的强有力分离，超微量蛋白的有效 检出。 （１）毛细管电泳检测毛细管电泳包括：①毛细 管ＳＤＳ凝胶电泳。该法主要是根据各组分通过检测 器时，在２１４ ｎｍ波长处产生吸收峰的时间和峰形， 鉴别出病原因子一Ｐ。该法标本用量少，不需免疫学 试剂，判断直观；但需超速离心机和毛细管电泳仪。 ②荧光标记肽链的毛细管电泳免疫测定法，是根据 免疫竞争原理，以毛细管电泳技术结合免疫荧光技 术，检测标本中微量的Ｐｒ。该法灵敏度很高，可用于 检测朊病毒含量很低的脑外组织（如血液等）。 （２）双色强荧光目标扫描法该法是运用共聚焦 双色荧光相关分光镜技术检测微量的朊病毒。根据 异常的朊病毒蛋白在适当条件下自我复制和自发 聚集的特点，分别用绿色荧光标记重组的ＰｒＰ（ｒＰｒＰ） 和标有红色荧光的特异性抗体进行反应，其结果中 同时显示红、绿两种荧光的颗粒。即可被仪器检测 为具有侵染性的朊病毒蛋白Ｐ。该方法特异性很好、 灵敏度极高，可检测到２ｐｍｏｌ的Ｐｒ。检测采样早期 大都是基于机体脑部组织，随着检测研究的深入及 灵敏度的提高，逐渐发展了其他组织检测。英国、德 国、瑞士等国成功地以血液为检测对象检测ＢＳＥ。 美国、以色列等国以尿液为检测对象检测ＢＳＥ。其 次，在淋巴液及扁桃体等可检测到Ｐｒ，还可根据脑 ２洲年第６期◇ 专论与综述 脊液中脑蛋白ｌ４～３—３在感染ＰｒＰ前后含量的变化 来检测ＢＳＥ，称为脑脊液中标志蛋白的检测。 最近研究还发现，在ＣＪＤ病人的嗅觉器官上皮 组织中也可检测到ＰｒＰ（不是在呼吸黏液膜上）。这 组织。比尔特解释说，ＲＮＡ通常不稳定，但他们成功 找到了一个稳定的特征片断，聚合酶链反应后能够 检测出来。与传统的检测方法相比，新方法不仅可 以判断出肉类食物中所用的是哪种动物的中枢神 经组织，还可以精确测出所掺人组织的量。他说： 些给疯牛病的检测带来了新的检测途径，使疯牛病 的检测变得更加简单易行。 ２．８荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测方法 “新方法能帮助我们分清一根小香肠是否含有脑和 脊髓成分，如果有，它是来自火鸡或猪的，还是来自 像牛这类反刍动物的。前者是允许的，而后者则被 目前普遍认为，疯牛病是由于牛食人了被疯牛 病和羊痒病病原污染的饲料所致，而人的新型克一 雅氏症则是由于吃了被疯牛病病原污染的牛肉所 引起。因此，疯牛病问题一直是人们关注的焦点问 题之一。疯牛病是致死性的，牛肉是否携带ＢＳＥ病 原目前尚无定论，但牛肉在屠宰和加工过程中被特 殊风险物质污染的机会很多，一旦污染将难以消 除。所以，疯牛病发生后，许多国家都严格要求将 ＳＲＭ从食物链上剔除，各国学者都在研发牛肉或牛 肉产品被ＳＲＭ污染的检测方法。本研究应用荧光 ＲＴ—ＰＣＲ技术对牛肉中的疯牛病特殊风险物质进行 检测，由于疯牛病特殊风险物质主要集中于中枢神 经组织，其感染性占疯牛病总感染性的９９％，所以 对疯牛病特殊风险物质的检测都是通过检测中枢 神经组织的标记物来实现的。ＧＦＡＰ在中枢神经组 织中特异、稳定地表达，其它组织中很少或者没有， 是目前检测中枢神经组织的理想标记物。荧光 ＲＴ—ＰＣＲ技术是近几年来建立起来的比较成熟的检 测技术之一，该技术的原理是在普通ＰＣＲ反应的基 础上引入了更加特异的荧光探针，通过有无荧光释 放及释放的荧光强度来检测，因而与普通ＰＣＲ相 比，具有更加快速、敏感和特异的优势。 德国科学家开发成功了一种检测肉类食品的 新方法，可以准确区分出肉制品不同的动物来源， 进而查出其中是否含有牛、羊等反刍动物的脑或脊 髓组织。研究人员说，这种方法可以检测出肉类食 品是否受到污染，防范疯牛病。据德新社报道，新方 法是由德国吉森兽医与食品研究所米夏埃尔・比尔 特教授等开发的。传统的方法是检测肉类食品中是 否含有特定蛋白质，而新方法的检测标记物是核糖 核酸（ＲＮＡ）。动物中枢神经系统中含有胶质纤维酸 性蛋白，而合成这种蛋白质的过程中会产生信使 ＲＮＡ，通过实时聚合酶链反应，就能找到信使ＲＮＡ 的痕迹，进而判断肉类食品中是否掺人了脑或脊髓 ｎ ２ 侔 期 禁止使用。”科学界普遍认为，患病动物的脑、脊髓 等组织通过食物链传播，是疯牛病蔓延的主要原因。 多数国家都已禁止把反刍动物的脑和脊髓等添加 到饲料或食品中去，但如何检测食品中的这类成分 是个难题。新方法可望有助于防范疯牛病，据悉，研 究人员已申请专利，预计两年内可投人实用。 参考文献 【１］ｃｏｎｉｎｇｅ Ｊ．Ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ：ｔｈｅｉｒ Ｃｏ ＲＩＳｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓ【Ｊ］．Ａ ｒｌｎｕＲｅｖＮｅｕｍ Ｓｃｉ， ２００１，２４：５１９—５５０． ［２】Ｅｒｉｍｉａｓ Ｄ．Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｓｐｏｎ￣ｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ￣］．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｍｉｃｍｂｉｏｌ，１９９９，５３：２８３—３１４． ［３】许于飞，等．朊病毒分子生物学研究进展［Ｊ］＿中国人兽共 患病杂志，２００２，１８（４）：１０５—１０７． 【４］Ｅｂｕ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＰｒＰ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ Ｔｉｇｈｔｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｈｅｅｐ Ｐｒｉｏｎ 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