实 习 报 告
实习名称 系 别 年级专业 学生姓名 指导老师
微生物课程实习 生物与化学工程系 2010级生物工程 乐一鸣1040903054 蒋盛岩 王瑶琼
邵 阳 学 院
2010年 09月 19日
一．实习时间、实习地点和实习单位：
2010年9月3日—9月16日 邵阳学院李子园校区3栋104室
二．实习过程概述：
（一）实习动员会 2010年9月3日上午 （二）实习工作准备 1. 时间：2天 2. 内容
（1）分组制订详细的实习方案。 （2）分组选择和使用所需的仪器。
（3）分组配制各种试剂、培养基并进行正确的消毒与灭菌。 （三）乳酸菌的分离纯化 1. 时间：7天 2．内容
（1）无菌操作倒平板、十倍稀释法、划线分离或涂布平板法，恒温培养 （2）菌落观察与镜检 （3）筛选生产用菌株
⑷菌种传代培养（菌种活化与扩大化） （四） 乳酸菌饮料的制作 1. 时间：3天 2. 内容
（1）制备发酵液
（2）接种发酵菌剂并发酵生产 （3）观察发酵情况
（4）品尝发酵产品，进行质量评价 （5）记录结果 （五）书写实习报告 时间：1天
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三．主要实习岗位和实习内容：
1、实验药品 新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；
0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g；
2、 仪器与设备 高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线绳、标签、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯、酒精灯、石棉网、接种针（环）、擦镜纸 3. 操作步骤
3.1方案确立及领取物品
3.1.1 实验开始前我们组织了组员通过上网查资料和讨论等方式初步确立了实验方案，通过与老师协商，将实验方案进一步详细化，最终确立了方案。
3.1.2 9月5日上午领取25只试管、3个三角瓶、1个分液漏斗、10支移液管、2个量筒、2个洗个球、7个烧杯、一个台秤和一个试管架。 3.2 乳酸菌的分离纯化 3.2.1 分离
（1）配制BCG牛乳培养基，分装三角瓶，包扎，灭菌备用。 BCG牛乳培养基配制
A溶液：脱脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）
B溶液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g，PH6.8，121℃湿热灭菌20min。 以灭菌操作趁热将A溶液和B溶液混合均匀后倒平板。 结果与分析：
两次用80℃灭菌A液制成的BCG培养基菌检结果都染菌了，培养基呈淡绿色；而用106℃灭菌A液制成的BCG培养基菌检结果没染菌。
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说明我们80℃对A液水浴灭菌达不到灭菌要求，最后都用106℃灭菌的A液制作BCG培养基。
（2）样品的处理
按照无菌操作要求，从市售新鲜酸乳中吸取10ml检样，放入装有90ml无菌水的三角瓶内，振摇混匀。 （3）分离方法 ①倒培养基
在无菌室，先用紫外线照射半小时把表面菌灭了，在通风10min后，每培养皿倾注约15ml左右已溶化的BCG牛乳培养基，立即放在桌上摇匀，冷却凝固后即成平板。 ②十倍稀释法
将检样充分摇匀后，用十倍稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各种稀释度的样品液。 ③分离
直接用接种环蘸取10-4、10-5 两个稀释度的试管中原液，在BCG牛乳培养基琼脂平板上划线分离，每稀释度做两个平皿。置40℃培养箱中培养48h。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。 结果与分析：
我们蘸取10﹣5，10﹣4两个稀释度同时接种到两个培养基时，发现传代后，只有一个培养基上长出少量黄色菌落；
说明我们的检样浓度太低造成最后菌落太少，我们接下来都转而蘸取10﹣1,10﹣2两个稀释度的试管中原液，结果菌落比较多。 3.2.2 鉴别
（1）配制脱脂乳试管培养基，分装试管，包扎，灭菌备用。 脱脂乳试管培养基成分：20g脱脂奶粉，285ml灭菌水。
配制好的脱脂乳培养基分装到15支试管中。
（2）选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，40℃培养箱中培养8～24h。若牛乳出现凝固，无汽泡，呈酸性，涂片镜检细胞为杆状或链球状（两种形状的菌种分别选入），革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌种待用
革兰氏(Gram)染色液
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1．草酸铵结晶紫染液
A液：结晶紫(crystal violet) 1g，95%酒精 20ml B液：草酸铵(ammonium oxalate) 0．8g，蒸馏水 80ml 混合A、B二液，静置48小时后使用。 2．卢戈氏(Lugol)碘液
碘片 1．0g，碘化钾 2．0g，蒸馏水 300ml
先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。 3．95%的酒精溶液。 4．沙黄复染液
沙黄 0.25g，95%的酒精 10ml，蒸馏水 90ml 将沙黄溶于乙醇中，再用蒸馏水稀释
结果与分析：
我们挑取的乳酸菌微传代的第四代菌落，用了四小时就能凝乳，而且是黄色的菌落。进行革兰氏染色后，镜检结果革兰氏阳性菌，且全部为乳酸杆菌；
可能是奶粉中球菌的含量比较少，所以只分离出来杆菌，最后我们只好从其他组那接种到了乳酸球菌进行传代。
3.3 乳酸菌饮料的制作 3.3.1 乳酸菌培养基的制作
将脱脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min，冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。即脱脂乳14.3g，无菌水
100ml，蔗糖6g。
3.3.2 接种
将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种等量混合菌液作为发酵菌剂，均以2～5%的接种量分别接入培养基质中即为饮料发酵液。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的发酵液重复分装3～5瓶，将瓶盖拧紧密封。 3.3.3 发酵
将接种后的酸乳瓶置40～42℃培养箱中培养3～4h时。培养时注意观察，出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃冰箱中冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸度适中（pH4～4.5）,凝块均匀致密,无乳清晰出,无汽泡,获得较好口感和特有风味。 3.3.4 以品尝为标准评定酸乳质量 球菌 杆菌 凝乳情况 口感 香味 异味 PH值 豆腐脑状 甜味不够 奶香 无 豆腐脑状 酸味不够 无 有 4
混合菌1：1
结果与分析：
豆腐脑状 酸甜味 奶香 无 我们凝乳的都跟豆腐脑差不多，而且上层还含有少量糖水；纯杆菌做出来的有异味，且酸味不够；纯球菌做出来的很香；混合菌做出来的，有香味，且酸甜度刚好。 杆菌主要作用于前期发酵，分解蔗糖；球菌则主要作用于后熟阶段，产香产气；所以混合菌做出来的是效果最好的一组。而且蔗糖含量为总含量，否则会不够甜。
四．实习收获和重要心体会：
复习了培养基的制作，接种，以及超净工作台的使用和维护，复习了高压蒸汽灭菌锅的使用方法。还有实验时与各位同学的合作，实验时间的具体安排，以及流程的时间掌握，这些都是需要一点一点的计划和变化的。在整个实验过程中，需要一个主要的掌握者，合理安排工作，让每个人都有机会对实验本质内容加深理解。
五．存在的不足和建议：
每组的人数过多导致一部分的人没有事情可做，仪器混乱使用。
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