・３８８・主堡塞堕处型苤查！Ｑ！！生！旦箜！！鲞箜！塑堡塾ｉ！』垦！Ｐ曼！丛：里尘婴型垫！鱼：！尘：箜ｚ塑！：兰・实验研究・未成熟树突状细胞治疗小鼠克罗恩病曾放孙华文刘顺孙科明杨厚涞吴红学作者单位：４３００６０武汉大学人民医院胃肠外科消化系统疾病湖北省重点实验室通信作者：孙华文，Ｅｍａｉｌ，Ｓｕｎｈｕａｗｅｎ８８８＠１６３．ｃｏｒｎＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－９０３０．２０１６．０２．０３３【摘要】目的观察小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（ｉｍＤＣ）对２，４，６一三硝基苯磺酸（ＴＮＢＳ）诱导出的克罗恩病小鼠模型的治疗作用，探讨其缓解小鼠克罗恩病的作用机制。方法４０只小鼠随机分为４组，每组１０只，分为对照组、ＴＮＢＳ组、ｉｍＤＣ组和成熟树突状细胞（ｍＤＣ）组，除对照组予以乙醇灌肠外，其余３组都予以乙醇．ＴＮＢＳ混合溶液灌肠造模，在灌肠前后各１ｄ经尾静脉注射磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）或者细胞进行干预，对照组和ＴＮＢＳ组尾静脉注射ＰＢＳ，ｉｍＤＣ组尾静脉注射ｉｍＤＣ，ｍＤＣ组尾静脉注射ｍＤＣ进行干预。每天观察小鼠的一般状况，于造模第７天后处死小鼠，分别行疾病活动指数（ＤＡＩ）、结肠病理组织学（ＴＤＩ）和结肠大体形态损伤指数（ＣＭＤＩ）评分，用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法分析小鼠结肠组织白细胞介素一１０（ＩＬ．１０）、转化生子因子．Ｂ（ＴＧＦ．Ｂ）的表达，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析小鼠结肠组织叉头彬翅状螺旋蛋白３（Ｆｏｘｐ３）蛋白的表达。结果ＴＮＢＳ组的ＤＡＩ、ＣＭＤＩ、ＴＤＩ的评分别为（５．４２０－＋０．３２６）、（４．９２３±０．２２６）、（７．２００±０．８５１）分，较对照组明显升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），结肠组织抗炎因子ＩＬ一１０和ＴＧＦ—Ｂ分别为（６．１０３±１．１４０）、（２１．１６４±３．２５２）ｎｇ／Ｌ，调节性Ｔ细胞（Ｔｒｅｇ）转录因子Ｆｏｘｐ３的相对表达量为０．４３９２±０．０４５９，较对照组明显降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；ｉｍＤＣ能显著降低小鼠ＤＡＩ、ＣＭＤＩ、ＴＤＩ评分，下调抗炎因子ＩＬ・１０和ＴＧＦ－Ｂ和转录因子Ｆｏｘｐ３的水平；ｍＤＣ则显著升高小鼠ＤＡＩ、ＣＭＤＩ、ＴＤＩ评分，降低抗炎因子ＩＬ—ｌＯ和ＴＧＦ・Ｂ和转录因子Ｆｏｘｐ３蛋白的水平，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论本实验成功地制作出了小鼠克罗恩病模型，并证明ｍＤＣ能明显缓解小鼠克罗恩病模型的进程，而诱导Ｔｒｅｇ的产生可能是其缓解炎症的机制之一。【关键词】树突状细胞；克罗恩病；免疫耐受；调节性Ｔ细胞基金项目：国家自然科学基金（８１１７０３６８）ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｉｍｍａｔｕｒｅｄｅｎｔｒｉｔｉｃｔｅｎｏｎＣｒｏｈｎ’ｓｍｏ吣ｅｍｏｄｅｌ压硝Ｆａｎｇ，ＳｕｎＨｕａｗｅｎ，ＬｉｕＳｈｕｎ，ＳｕｎＫｅｍｉｎｇ，Ｙａ硝胁ｕｌａｉ．耽舶ｎｇｘｕｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＲｅｎｍｉｎＨｏｓｐｉｔａｌＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅｂｒＤｉｇｅｓｔｉｖｅ跏把ｍＤｕｅ嬲ｅ。Ｗｕｈａｎ钌蝴．Ｃ＾ｉｎａｏｆｃｏ玳唧以ｉ，曙ａ以ｈｏｒ：ＳｕｎＨｕａｗｅｎ，Ｅｎｔａｉｌ：Ｓｕｎｈｕａｗｅ，谲船＠１６３．ＣＯｌｌＺ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｍｍａｔｕｒｅｄｅｎｔｒｉｔｉｃｃｅｌｌ（ｉｍＤＣ）ｏｎｔｈｅＣｒｏｈｎ’ｓｍｉｃｅｍｏｄｅｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙ２，４，６一ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＴＮＢＳ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｍｏｕｓｅｗｅｒｅｒａｎ—ｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ４ｇｒｏｕｐｓ：ｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ，ＴＮＢＳｇｒｏｕｐ，ｉｍｍａｔｕｒｅｄｅｎｔｒｉｔｉｃｃｅｌｌ（ｉｍＤＣ）ｇｒｏｕｐ，ｍａｔｕｒｅｄｅｎｔｒｉｔｉｃｃｅｌｌ（ｍＤＣ）ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｏｔｈｅｒｔｈｒｅｅｇｏｕｒｐｓｗｅｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ５０％ｅｔｈａｎ０１／ＴＮＢＳｖａｉｎａｎｕｓｅｘ—ｃｅｐｔｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，Ｅａｃｈｇｒｏｕｐｗａｓｉｎｊｅｃｔｅｄｓａｌｉｎｅｏｒｃｅｌｌｓｖｉａｔａｉｌｖｅｉｎｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆａｎｕｓｅｎｅｍａ．ＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄＴＮＢＳｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄｓａｌｉｎｅ．ｉｍＤＣｇｒｏｕｐｗａｓｉｎｊｅｃｔｅｄｉｍＤＣ．ｍＤＣ—ｇｒｏｕｐｗａｓｉｎｉｅｃｔｅｄｍＤＣ．Ｔｈｅｎｗｅｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｇｅｎｅｒａｌｓｉｔｕａｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅ．Ａｆｔｅｒｏｎｅｗｅｅｋ．ｔｈｅｄｉｓｅａｓｅａｃ—ｔｉｖｉｔｙｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ），ｔｉｓｓｕｅｄａｍａｇｅｉｎｄｅｘ（ＴＤＩ）ａｎｄｃｏｌｏｎｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃｄａｍａｇｅｉｎｄｅｘ（ＣＭＤＩ）ｗｅｒｅｅｖａｌｕ—ａｔｅｄ，ｔｈｅｃｏｌｏｎｌｅｖｅｌｏｆｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１０（ＩＬ一１０），ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ—Ｂ（ＴＧＦ—Ｂ）ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬｌＳＡ）．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｃｏｌｏｎｆｏｒｋｈｅａｄ／ｗｉｎｇｅｄｈｅｌｉｘｐｒｏｔｅｉｎ３（Ｆｏｘｐ３）ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｓｃｏｒｅｓｏｆＤＡＩ．ＣＭＤＩ．ＴＤＩｉｎＴＮＢＳｇｒｏｕｐｗｅｒｅ５．４２０４－０．３２６，４．９２３４－０．２２６，７．２００４－０．８５１，ｉｎｃｒｅｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．ＡｎｄｔｈｅｃｏｌｏｎｔｉｓｓｕｅｌｅｖｅｌｏｆＩＬ一１０，ＴＧＦ—Ｂｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅ（６．１０３±１．１４０），（２１．１６４±３．２５２）ｎｇ／Ｌ，ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ０．４３９２±０．０４５９．ｄｅｃｒｅｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ—ｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｒｏｔｒ０１ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．ＩｍＤＣｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅｓｃｏｒｅｓｏｆＤＡＩ，ＣＭＤＩ，ＴＤＩａｎｄｉｎｃｒｅｓｅｔｈｅｃｏｌｏｎｔｉｓｓｕｅｌｅｖｅｌｏｆＩＬ—１０。ＴＧＦ—Ｂ，Ｆｏｘｐ３ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０５）．ＢｕｔｔｈｅｍＤＣｉｎ．ｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｓｃｏｒｅｓｏｆＤＡＩ，ＣＭＤＩ，ＴＤＩａｎｄｄｅｃｒｅｓｅｔｈｅｃｏｌｏｎｔｉｓｓｕｅｌｅｖｅｌｏｆＩＬ一１０，ＴＧＦ—Ｂ。Ｆｏｘｐ３ｐｒｏ．ｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＷｅｓｕｃｃｓｅｆｕｌｌｙｉｎｄｕｃｅＣｒｏｈｎ’ｓｍｉｃｅｍｏｄｅｌｓｂｙ’ｒＮＢＳ．ＡｎｄｏｂｓｅｖｅｔｈｅｉｍＤＣｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈａｂｉｔｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎＣｒｏｈｎ’ｓｍｉｃｅｍｏｄｅｌｓａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｍ一万方数据史堡塞验窆Ｅ整盘查！Ｑ！鱼生！旦筮塑鲞筮！塑垦ｉ垫』坠Ｅ！！垡：堡垒型！翌！Ｑ！！：！尘：塑：盟！：！ｍｕｎｅ・３８９・ｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｉｍＤＣｍｉｇｈｔｂｅｉｎｈｉｂｉｔＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓｂｙｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ．ｃｅｌｌ；Ｃｒｏｈｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ；Ｉｍｍｕｎｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓＦｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８１１７０３６８）【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ炎症性肠病分为克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一种慢性反复发生的消化道炎症性疾病，尽管到目前为止其病因尚未明确，但是可以明确的是中心和外周免疫系统的紊乱是导致其发生发展的重要因素…。以小鼠为模型的实验性结肠炎是一种广为认可的以辅助性Ｔ细胞ｌ（１１１１）为主导的克罗恩病模型，用２，４，６一三硝基苯磺酸（ＴＮＢＳ）灌肠法可以制备出与人类相似的疾病模型怛１。树突状细胞（ＤＣ）是体内最强的抗原提呈细胞，是连接固有免疫和特异性免疫的重要桥梁。目前研究发现ＤＣ的免疫应答到底是导致免疫失能还细胞（ｍＤＣ）高表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子（ＭＨＣ．Ⅱ）和共同刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６，可诱导ＣＤ４＋细胞（ｉｍＤＣ）低表达ＭＨＣ一１１和共同刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６，可能导致免疫失能∞Ｊ。有研究表明，后者的作用机制可能为诱导ＣＤ４＋Ｔ细胞向调节性Ｔ细胞（Ｔｒｅｇｓ）分化，而Ｔｒｅｇｓ分泌免疫抑制因子白细胞介素－１０（ＩＬ－１０）、转化生子因子一ｐ（ＴＧＦ—ｐ），导致外周免疫耐受ＨＪ。我们通过ＴＮＢＳ灌肠法制作出小鼠克罗恩病的模型，经尾静脉输注制备的同种小鼠骨髓来源的ｍＤＣ和ｉｍＤＣ，通过评价各组小鼠的疾病指数，检测相关抗炎因子，探讨成熟与未成熟的ＤＣ对小鼠克罗恩病模型的作用以及作用机制。材料与方法１．材料：６～８周龄雌性ＢＡＬＢ／ｅ小鼠５０只，购于武汉大学动物实验中心［许可证号：ＳＣＸＫ（鄂）２０１４—司，为５％（Ｗ／Ｖ）的水溶液；重组小鼠白细胞介素４（ｒｍｌＬ４）和重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｒｍＧＭ．ＣＳＦ）购于Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ公司；脂多糖（ＬＰＳ）购于Ｓｉｇｍａ公司；三氢一吲哚菁型染料（ＰＥ—ｃｙ７）标记的抗鼠ＣＤｌｌＣ抗体、藻红蛋白（ＰＥ）标记的抗小鼠ＣＤ８０、藻蓝蛋白（ＡＰＣ）标记的抗小鼠ＣＤ８６、异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记的ＭＨＣ．１１购于美国ＢＤ公司；ＩＬ－１０、ＴＧＦ．Ｂ酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测试剂盒购于Ｒ＆Ｄ公司；叉头彬翅状螺旋蛋白３（Ｆｏｘｐ３）抗体购于武汉三鹰公司；设备：ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ流式细胞仪（美国ＢＤ公司）、倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司，ＩＸ７１）。２．小鼠骨髓源ｉｍＤＣ和ｍＤＣ的制备及鉴定：（１）万方数据细胞的分离及培养：将ＢＡＬＢ／ｃ小鼠颈椎脱臼法处死，参照文献［５］的步骤稍加改进，收集骨髓单个核细胞，加入含有１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基，调整密度为１×１０９／Ｌ，每孔４ｍ１培养基，添加细胞因子ｒｍｌＬ４（１０肛ｇ／Ｌ）和ｒｍＧＭ—ＣＳＦ（１０斗ｇ／Ｌ），分布于６孑Ｌ板中，于３７℃、５％ＣＯ：培养箱中孵育，第３天取６孔板各孑Ｌ悬浮培养基２ｍｌ继续放人新的６孔板中，原６孔板及新的６孑Ｌ板各加入２ｍｌ带细胞因子的新鲜培养基继续培养，于第７天收集的悬浮的和半贴壁细胞为ｉｍＤＣ，同时设置对照组，在培养的第６天加入脂多糖（１ｍｇ／Ｌ），２４ｈ后收集的细胞为ｍＤＣ。（２）形态学检测：每天在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况。（３）细胞表面标志物的流式细胞仪检测：收集ｉｍＤＣ和ｍＤＣ，调整密度为１×１０９／Ｌ，在１００斗ｌ的反应体系中分别加入抗小鼠的ＰＥ．ｃｙ７．ＣＤｌｌＣ、ＰＥ．ＣＤ８０、ＡＰＣ．ＣＤ８６、ＦＩＴＣ．ＭＨＣ．１１避光孵育３０ｍｉｎ后以磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）洗涤２次，后加入４％多聚甲醛固定后上流式细胞仪检测。３．动物分组及小鼠克罗恩病模型的制备：将４０只小鼠随机分为４组，每组１０只，分为对照组（５０％乙醇灌肠后尾静脉注射ＰＢＳ）；ＴＮＢＳ组（乙醇ＴＮＢＳ混合溶液灌肠后尾静脉注射ＰＢＳ）；ｉｍＤＣ组（乙醇ＴＮＢＳ混合溶液灌肠后尾静脉注射ｉｍＤＣ）；ｍＤＣ组（乙醇ＴＮＢＳ混合溶液灌肠后尾静脉注射ｍＤＣ）。参照文献［６］方法稍加改进，给予禁食不禁水饲养２４ｈ，灌肠前刺激其应激促进排便后，用３．５Ｆ导管（医用石蜡油涂抹）从肛门插入肠道深度约５ｃｍ，对照组灌注５０％乙醇０．１ｍｌ，另外３组灌注ＴＮＢＳ一５０％乙醇混合溶液０．１ｍ１（１体积ＴＮＢＳ水溶液与１体积无水乙醇混匀），缓慢注入，拔管后继续保持倒立姿势１ｍｉｎ。各组在灌肠前后１ｄ经尾静脉注射ＰＢＳ或者细胞进行干预，对照组和ＴＮＢＳ组经尾静脉注射１００ｔｘｌＰＢＳ，ｉｍＤＣ组经尾静脉注射１００仙ｌ含１×１０６个ｉｍＤＣ细胞的ＰＢＳ，ｍＤＣ组经尾静脉注射１００Ｉｘｌ含１×１０６个ｍＤＣ细胞的ＰＢＳ。４．模型的评价：依据文献［７］评价方法行小鼠的疾病活动指数（ＤＡＩ）、组织病理学损伤指数（ＴＤＩ）、结肠大体形态损伤指数（ＣＭＤＩ）评分。５．酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法测定结肠组织抗炎因子ＩＬ．１０和ＴＧＦ—Ｂ：将结肠组织进行冰ＰＢＳ冲洗，滤纸拭干后称取１０ｍｇ结肠组织，加入１ｍｌＰＢＳ（ｐＨ６．０，内含１仙ｇ抑肽酶、亮肽素胃酶抑素Ａ），用眼科剪剪碎后放入匀浆器进行匀浆，４℃１２０００ｇ／ｍｉｎ离心是诱导免疫主要取决于ＤＣ的成熟状态，成熟树突状Ｔ细胞向Ｔｈｌ分化，诱导免疫的发生，而未成熟树突状０００４］，饲养于武汉市第三医院。ＴＮＢＳ购于Ｓｉｇｍａ公・３９０・坚生塞堕窆Ｅ整盘查！Ｑ！！生！旦簋塑鲞筮！塑堡！也』垦狸！旦垡：旦！坐！盟垫！！：！堂：！！：奠！：１２０ｍｉｎ，取上清液，按ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书检测ＩＬ・１０６．Ｗｅｓｔｅｒｎ０．７４３）分，较ＴＮＢＳ组明显升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。４．小鼠结肠组织ＥＬＩＳＡ法测定ＩＬ－１０和ＴＧＦ一１３结果：ＴＮＢＳ组小鼠结肠组织抗炎因子ＩＬ一１０、ＴＧＦ—ｐ表达和ＴＧＦ一１３的浓度。ｂｌｏｔ法测定结肠组织Ｆｏｘｐ３蛋白的表达：提取结肠组织总蛋白，取５０斗ｇ蛋白上样电泳、转膜、封闭，将Ｆｏｘｐ３抗体按ｌ：１０００稀释，加入相应二抗后室温孵育２ｈ，用增强化学发光法显色、曝光、冲洗、扫描、摄像，采用ＢａｎｄＳｃａｎ对条带进行分析，计算灰度值，以甘油醛一３一磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）为内参，计算Ｆｏｘｐ３的相对表达量。７．统计学方法：计量数据以均数±标准差（面±ｓ）表示，应用ＳＰＳＳ１９．０统计软件分析，采用ｔ检验，以水平较对照组明显降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；ｉｍＤＣ组抗炎因子ＩＬ一１０、ＴＧＦ—Ｂ表达水平较ＴＮＢＳ组明显升高，而ｍＤＣ组抗炎因子ＩＬ－１０、ＴＧＦ－Ｂ表达水平较ＴＮＢＳ组明显降低，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０１，表１）。表１各组小鼠结肠组织ＩＬ一１０、ＴＧＦ—Ｂ含量（ｎ＝１０，ｎｇ／Ｌ，元±５）Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。结果１．细胞形态学观察：培养２４ｈ后可见大量贴壁细胞，贴壁的单个核细胞均匀分布，２ｄ后有大量集落形成，开始有少量细小突起，５ｄ后细胞集落减少，细胞体积增大，ＤＣ从集落中脱落下来，悬浮细胞增多，发丝样突起明显增多，胞浆呈亮黄色（图１）。５．小鼠结肠组织Ｆｏｘｐ３蛋白检测结果：ＴＮＢＳ组小鼠结肠组织Ｆｏｘｐ３蛋白相对表达量为０．４３９２±０．０４５注：ＩＬ一１０：白细胞介素－１０；ＴＧＦ—Ｂ：转化生子因子一Ｂ；ＴＮＢＳ：２，４，６一三硝基苯磺酸；ｉｍＤＣ：未成熟树突状细胞；ｍＤＣ：成熟树突状细胞；与对照组比较，ａｐ＜Ｏ．０ｌ；与ＴＮＢＳ组比较，ｂｐ＜０．０５ｅＱ’‘●。一・．．心ｊＤ９，较对照组（０．６９８６±０．０８１４）明显降低，差异嚆≤７Ｇ（）／ｏ一◇ｊ◇ｊＺ、＾ｋ翟有统计学意义（Ｐ＜０．０１），ｉｍＤＣ组Ｆｏｘｐ３蛋白相对表达量为０．５４３４±０．０７４１，较ＴＮＢＳ组明显升高，而ｍＤＣ组Ｆｏｘｐ３蛋白蛋白相对表达量为０．２２７５±０．０４３ｌ，较ＴＮＢＳ组明显降低，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０１，图２）。Ｉ心∥Ｏ图１倒置显微镜下观察培养第７天树突状细胞的形态（ｘ４００）２．细胞表面标志物的流式检测：通过流式细胞术检测ＤＣ的特异性表面标志物ＣＤｌｌｃ的阳性率为８５％，ｉｍＤＣ的表面ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ—ＩＩ的表达率分别为３１．２％、２６．５％、３９．８％，ｍＤＣ的表面ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ—ｌＩ的表达率分别为９０．５％、９２．６％、９２．３％，与文献报道一致旧Ｊ。３．小鼠ＤＡＩ、ＣＭＤＩ、ＴＤＩ评分结果：ＴＮＢＳ组的ＤＡＩ、ＣＭＤＩ、ＴＤＩ的评分别为（５．４２０±０．３２６）、（４．９２３±讨论ｌ：对照组；２：ＴＮＢＳ组；３：ｉｍＤＣ组；４：ｍＤＣ组；Ｆｏｘｐ３：叉头彬翅状螺旋蛋白３；ＧＡＰＤＨ：甘油醛．３＿磷酸脱氢酶；ＴＮＢＳ：２，４，６－三硝基苯磺酸；ｉｍＤＣ：未成熟树突状细胞；ｍＤＣ：成熟树突状细胞图２各组小鼠结肠组织Ｆｏｘｐ３蛋白的表达０．２２６）、（７．２００±０．８５１）分，较对照组明显升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；ｉｍＤＣ组的ＤＡＩ、ＣＭＤＩ、ＴＤＩ的评分分别为（３．２７０±０．３５９）、（３．５５３±０．３１１）、（４．３１０－０．４８６）分，较ＴＮＢＳ组明显降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；ｍＤＣ组的ＤＡＩ、ＣＭＤＩ、ＴＤＩ的评分分另０为（６．５８０±０．４１３）、（５．９５０±０．３０３）、（９．０５０±ｉｍＤＣ低表达ＭＨＣ－Ⅱ和共同刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６，不能将其抗原的信息提供给幼稚的Ｔ细胞，从而导致效应Ｔ细胞的缺失，引起免疫耐受，ｉｍＤＣ这一特点在诱导抑制排斥反应和减轻自身免疫性疾病中的作用目前已有了初步的研究＂，９Ｊ。本实验成功培养出ｉｍＤＣ及ｍＤＣ，ｉｍＤＣ经细胞流万方数据史＿垡塞坠处型盘查！！！！生！旦筮塑鲞笠！塑ｇｂ地』旦塑！！坚：壁！型型！！！！：！尘：ｊ！：盟！：！・３９ｌ・式检测显示：ＣＤｌｌｃ＋ＣＤ８０ｋ”ＣＤ８６１０”ＭＨＣ．ＩＩｈ，符合疫抑制因子，从而缓解小鼠克罗恩病模型的进程。参考文献ｌＢｏｕｍａＧ，ＳｔｒｏｂｅｒｍａｔｏｒｙｂｏｗｅｌｉｍＤＣ的表现，而ｍＤＣ经细胞流式仪检测显示ＣＤｌｌｃ＋ＣＤ８０…ｇｈＣＤ８６“印ＭＨＣ—ＩＩｈｉｇｈ，符合ｍＤＣ的表型，并于ＴＮＢＳ灌肠造模前和造模后经尾静脉将ｉｍＤＣ和ｍＤＣ输入小鼠体内后，根据ＤＡＩ、ＴＤＩ及ＣＭＤＩ评分发现ｉｍＤＣ组小鼠的病情明显减轻，而ｍＤＣ组小鼠的病情较ＴＮＢＳ组明显加重。有研究证实Ｔｒｅｇｓ在外周免疫耐受起着重要的作用¨０｜，为了进一步探讨ＴｒｅｇｓＷ．Ｔｈｅｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｂａｓｉｓｏｆｉｎｆｌａｍ—Ｒｅｖｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ，２００３，３（７）：５２１－５３３．Ｒｅｖｌｍｍｕｎｏｌ，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎ一１１３２．［２］［３］ＮｅｕｒａｔｈＭ，ＦｕｓｓＩ，ＳｔｒｏｂｅｒＷ．ＴＮＢＳ－ｃｏｌｉｔｉｓ［Ｊ］。Ｉｎｔ２０００。１９（１）：５１．６２．ＦｕｊｉｉｄｉｔｉｏｎＳ，ＬｊｕＫ，ＳｍｉｔｈＣ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｌｉｎｋａｇｅｏｆｉｎｎａｔｅｔｏａｄａｐｔｉｖｅｉｍｍｕ—ｎｉｔｙｖｉａｍａｒｒｉｎｇｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｖｉｖｏｒｅｑｕｉｒｅｓＣＤ４０ｌｉｇａｔｉｏｎｉｎａｄ．ｔｏａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＣＤ８０／８６ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＥｘｐ是否在ｉｍＤＣ诱导的免疫耐受机制起了作用，本实验通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法测定Ｔｒｅｇｓ特异性转录因子４Ｍｅｄ，２００４。１９９（１２）：１６０７—１６１８．ＤＯＩ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２００４０３１７．ｕＢ，ＴｉａｎＬＨ，ＤｉａｏＹＭ，ｅｔａ１．ＥｘｏｇｅｎｏｕｓＩＬ－１０ｉｎｄｕｃｅｓｃｏｒｎｅａｌｔｒａｎｓ—Ｆｏｘｐ３，这种因子在维持Ｔｒｅｇｓ生长和其功能中起着重要的作用，根据其表达量的变化来推断Ｔｒｅｇｓ的数量，结果发现给予ＴＮＢＳ后Ｆｏｘｐ３表达明显下降，与文献报道一致…１；而ｉｍＤＣ组小鼠结肠组织的Ｆｏｘｐ３蛋白较ＴＮＢＳ组明显升高，ｍＤＣ组小鼠结肠组织的Ｆｏｘｐ３蛋白较ＴＮＢＳ组明显降低，我们由此推断ｉｍＤＣ可能是通过诱导Ｔｒｅｇｓ的生成而减缓小鼠克罗恩病的进程。为了进一步验证上诉结果，本实验通过ＥＬＩＳＡ法检测结肠组织ＴＧＦ－Ｂ和ＩＬ－１０的表达，ＴＧＦ一１３和ＩＬ一１０都是由Ｔｒｅｇｓ细胞分泌的抗炎因子，而ＴＧＦ．Ｂ和ＩＬ．１０又能进一步促进Ｔｒｅｇｓ的形成¨２。３。，本实验结果发现给予ＴＮＢＳ灌肠造模后，ＴＧＦ一１３和ＩＬ．１０细胞因子明显降低，给予ｉｍＤＣ处理后其表达水平明显上升，而在ｍＤＣ组中，其表达水平明显下降，上述结果都说明了ｉｍＤＣ能明显增加Ｔｒｅｇｓ的数量，所以我们推测ｉｍＤＣ的作用可能是通过增加Ｔｒｅｇｓ细胞的数量，进而上调抗炎因子ＴＧＦ—Ｂ和ＩＬ一１０分泌，从而诱导免疫耐受，减轻炎症反应。本实验发现，虽然ｉｍＤＣ经尾静脉输注小鼠体内［９］［７］６ｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｌｍａｎｅｔｏｌｅｒａｎｅｅｂｙＭｅｄａｍｅｃｈａｎｉｓｍａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｌｔｅｒｅｄ１１１１／Ｔｈ２ｃｙｔｏｋｉｎｅｒａｔｉｏａｎｄｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＧＦ一１３『Ｊ］．ＭｏｌＲｅｐ，２０１４，９（６）：２２４５－２２５０．ＤＯＩ：１０．３８９２／ｍｍｒ＋２０１４．２０７３．［５］吴舰宇，宋春芳，许评，等．应用骨髓法培养树突状细胞的研究［Ｊ］．中华实验外科杂志，２００５，２２（７）：７９６－７９７．ＷｕＪＹ，ＳｏｎｇＣＦ，ＸｕＰ．ｅｔａ１．Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｄｅｎｔｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｂｙｂｏｎｅｍａｒ－ｌＯＷｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ＣｈｉｎＪＥｘｐＳｕｒｇ，２００５，２２（７）：７９６－７９７．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｊ．ｉｓｓｎ．１００ｌ－９０３０．２００５．０７．叭１．ＫｉｍＳＨ，ＢｉａｎｃｏＮＲ，ＳｈｕｆｅｓｋｙＷＪ，ｅｔａ１．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｉｎｆｌａｍ—ｇｅ—ｍａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｍｏｄｅｌｓｗｉｔｈｅｘｏｓｏｍｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄ２２４２－２２４９．ｔｏｅｘｐｒｅｓｓＩＬ４［Ｊ］．Ｊｌｍｍｕｎｏｌ，２００７，１７９（４）：ＤＯＩ：１０．４０４９／ｉｉｍｍｕｎ０１．１７９．４．２２４２．ＹａｎｇＸＪ，ＭｅｎｇＳ，ＪｉａｎｇＨ，ｅｔａ１．Ｅｘｏｓｏｍｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｉｎｔｃｒｌｅｕｋｉｎ一ｃａｌｌ１０．ｔｒｅａｔｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｄｕｃｅｄ１１７７．ｒａｔｉｎｈｉｂｉｔｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｅａｃｉｄ—ｉｎ—ｃｏｌｉｔｉｓ［Ｊ］．ＳｃａｎｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１０，４５（１０）：１１６８一ＤＯＩ：１０．３１０９／００３６５５２１．２０１０．４９０５９６．８］ＨａｎＴｆｌ，ＪｉｎｍａｔｕｒａｔｉｏｎＰ，ＲｅｎＪ，ｅｔａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｃｌｉｎｉｃａｌｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅａｎｄｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ—ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｇａｍｍａ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００９，３２（４）：３９９４０７．ＤＯＩ：１０．１０９７／ＣＪＩ．０ｂ０１３ｅ３１８１９ｅ１７７３．ＣｈｅｎＬＨ，ＺｈｅｎｇＬ，ＨｅｗＢ，ｅｔｉｎｔｏｉｍｍａｔｕｒｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓａ１．ＣｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈＩＬ．１０ａｎｄＴＧＦ．ＢａｅｎｈａｎｃｅｓｉｎｎｎＨｕｅｔｏｌｅｒａｎｅｅｉｎｒａｔｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｍｏｄｅｌＪ１．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔＬｉｖｅｒＰｈｙｓｉｏｌ，２０１４．３０６（７）：５７５－５８１．ＤＯＩ：１０．１１５２／ａｊｐｇｉ．００２８３。２０１３．［１０］Ｌｅａｖｙ０，ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ：ＹｏｕｎｇＡＩＲＥｓｇｏｏｎｔｏｒｕｌｅ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖ能明显减轻小鼠克罗恩病进程，但是还是无法消除其炎症反应，可能原因是在体外未成熟的ＤＣ经小鼠尾静脉输注小鼠体内后在复杂的环境作用下表型经历变化，ＣＤ８０、ＣＤ８６和ＭＨＣ一１Ｉ表达上调，使其变成ｍＤＣ，我们下一步将通过基因修饰ＤＣ来使其保持稳定的未成熟状态。本研究结果表明，ｉｍＤＣ有可能是一方面通过减弱１１Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５，１５（５）：２６９．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｒｉ３８４９．ＧａｏＸＷ，ＦｕＹ，ＬｉＷＪ，ｅｔａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｍｍｕｎｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｏｎｏｒｄｅｒｉｖｅｄｉｍｍａｔｕｒｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｒａｔｈｉｇｈ．ｒｉｓｋｃｏｒｎｅａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＩｎｔＪＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２０１３，１８，６（３）：２６９－２７５．ＤＯＩ：１０．３９８０／ｉ．ｉｓｓｎ．２２２２－３９５９．２０１３．０３．０３．［１２］ＭｏｃｅｌｌｉｎＭｃ，ＷａｎｇＥ，ｅｔａ１．ＴｈｅｄｕａｌｒｏｌｅｏｆＩＬ一１０ｆＪ］．１１ｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎ０１，２００３，２４（１）：３６４３．Ｓ，ＰａｎｅｌｌｉＤＯＩ：１０．１０１６／Ｓ１４７１－４９０６（０２）００００９—１．［１３］ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＪＪ，ＫｅｌｌｙＴＧＦ一１３Ａ，ＳｍｅｄｌｅｙＣ，ｅｔａ１．Ｉｎｔｅｇｒｉｎａｖｌ３８一ｍｅｄｉａｔｅｄｓｕｐ—ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙｅｆｆｅｅｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒＤＣ的抗原提呈功能，阻断Ｔ细胞活化的必须第二信号，抑制其活化效应Ｔ细胞的产生。而另一方面通过促进ＣＩＭ＋Ｔ细胞向Ｔｒｅｇｓ细胞分化，分泌ＴＧＦ—ｐ和ＩＬ一１０免ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴ－ｃｅｌｌ—ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１５，４２（５）：９０３－９１５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕａｉ．２０１５．０４．０１２．（收稿日期：２０１５－１０—１９）《中华实验外科杂志》已启用万方数据论文相似性检测系统本刊编辑部已启用万方数据论文相似性检测系统，并将其作为审稿的一个重要工具。论文相似性检测系统为互联网在线模式，设有强大的文献对比数据库，实时更新，具有科学性和专业性。该系统可以自动检测来稿复制率情况，有效地识别和淘汰了部分存在学术不端的论文。此举将严把学术质量关，为广大作者、读者提供一个公平、公正、权威的学术交流平台，维护本刊刊稿的严肃性和科学性。本刊对复制率超过３０％的稿件不予采用。万方数据
