第４７卷５６ 第１期 哈尔滨医科大学学报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＡＲＢＩＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｏ１．４７．Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．，２０１３ ２０１３年２月 免疫组化和ＰＣＲ检测乳腺癌Ｈｅｒ一２、ＥＧＦＲｔ和 ＣＫ５／６过表达水平用于乳腺癌疗效的评估 陈颖 ，李睿，刘 源，濮杰，史春颖，戚基萍，王兵，张凌 （哈尔滨医科大学附属第一医院放射线科，黑龙江哈尔滨１５０００１） ［摘要］ 目的 比较免疫组化方法（ＩＨＣ）和实时定量ＰＣＲ（ＲＴ—ＰＣＲ）对乳腺癌易感基因Ｈｅｒ－２、ＥＧＦＲ、 ＣＫ５／６在乳腺癌治疗和预后中的应用。方法 对４１例乳腺癌患者分别进行癌组织ＩＨＣ和ＲＴ—ＰＣＲ检 测．测定癌组织Ｈｅｒ一２、ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６基因的过表达水平，分析比较两种方法检测的灵敏度和特异性。结 果４１例乳腺癌患者均为女性，应用免疫组化方法，Ｈｅｒ－２阳性表达２１例，ＥＧＦＲ呈阳性表达８例，ＣＫＳ／ ６阳性病例８例；应用ＲＴ．ＰＣＲ方法，Ｈｅｒ一２阳性表达２７例，ＥＧＦＲ呈阳性表达２１例，ＣＫ５／６阳性病例２ｌ 例。其中Ｈｅｒ－２应用两种方法所得阳性率没有统计学差别；ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６应用两种方法所得阳性率不 同，Ｐ＜０．０１。结论免疫组化方法与ＲＴ—ＰＣＲ方法相比较，乳腺癌组织ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６等基因在不同组 织中的扩增和蛋白过表达具有差异性，Ｈｅｒ－２不具有差异性，ＲＴ・ＰＣＲ方法敏感性和准确性更高，但二者 具有一致性。 ［关键词］乳腺癌；易感基因；免疫组化；ＲＴ—ＰＣＲ ［中图分类号］Ｒ７３７．９ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１０００—１９０５（２０１３）ｏｌ一００５６—０４ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒ－２，ＥＧＦＲ ａｎｄ ＣＫ５／６ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ＣＨＥＮ Ｙｉｎｇ，ＬＩ Ｒｕｉ，ＬＩＵ Ｙｕａｎ，ＰＵ Ｊｉｅ，ＳＨＩ Ｃｈｕｎ—ｙｉｎｇ，ＱＩ Ｊｉ－ｐｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｂｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＲａｄｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＨａｒｂｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５０００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃ— ｅｒ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＨＣ）ａｎｄ ｒｅａ１．ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ＲＴ—ＰＣＲ）ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃ－ ｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ Ｈｅｒ一２、ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ Ｈｅｒ－２，ＥＧＦＲ，ＣＫ５／６ ｇｅｎｅ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＩＨＣ ａｎｄ ＲＴ—ＰＣＲ ｉｎ ４１ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉ－ ｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｆｏｒｔｙ．ｏｎｅ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｗｅｒｅ ｗｏｍｅｎ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｓｈｏｗｅｄ ２ １ ｃａｓｅｓ ｏｆ Ｈｅｒ－２ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，８ ｃａｓｅｓ ｏｆ ＥＧＦＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ ８ ｃａｓｅｓ ｏｆ ＣＫ５／６－ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｂｕｔ ＲＴ—ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｅｄ Ｈｅｒ－２ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ２７ ｃａｓｅｓ，ＥＧＦＲ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ２１ ｃａｓｅｓ，ａｎｄ ＣＫ５／６ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ２１ ｃａｓｅｓ．Ｈｅｒ．２ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆ Ｐ＞ Ｏ．０５）；ＥＧＦＲ，ＣＫ５／６ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ（Ｐ＜ ０．０５ １．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＦＲ ａｎｄ ＣＫ５／６ ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏ． ｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ．ｂｕｔ Ｈｅｒ－２ ｈａｓ ｎｏｔ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ．ＲＴ．ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ［收稿日期］２０１２—１２—２０ ［基金项目］黑龙江省教育厅科学技术研究项目（１ １５５１２８５） ［作者简介］陈颖（１９６４一），女，黑龙江哈尔滨人，主任医师，博 士。 通讯作者 第１期 陈颖，等．免疫组化和ＰＣＲ检测乳腺癌Ｈｅｒ－２、ＥＧＦＲ和ＣＫ５／６过表达水平用于乳腺癌疗效的评估 ５７ ｈｉ曲ｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ，ｂｕｔ ｔｈｅｉｒ ｒｅｓｕｈｓ ａｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ；ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ；ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＲＴ—Ｆ ＣＲ 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，流行病学资 料表明，乳腺癌是经济发达国家的一种富贵病，表现 ｍｉｎ使ＲＮＡ沉淀干燥，加入ＤＥＰＣ水溶解，在波长 ２６０ ｎｍ处测定核酸浓度，波长２８０ ｎｍ处测定蛋白 为进食富于脂肪和蛋白质的高热量饮食，同时缺乏 体力活动。一随着我国经济水平的不断进步，乳腺癌 的发病率呈现逐年上升的趋势，已于西方经济发达 国家基本持平。近年来乳腺癌的易感基因Ｈｅｒ－２、 质浓度，二者比值在１．８～２．１时表示ＲＮＡ提取成 功，立即将ＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ。 逆转录反应：取灭菌且无核酸酶的０．２ ｍＬ ＰＣＲ 反应管。依次加入总ＲＮＡ、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ蹦ｍｅｒ（５０ ｍ） ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６更成为人们研究的热点，为乳腺癌的 治疗和预后提供重要的依据，本研究采用免疫组化 和实时定量ＰＣＲ两种方法，对４１例乳腺癌患者易 感癌基因Ｈｅｒ．－２、ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６表达情况进行分析， 探讨ＩＨＣ和ＲＴ－．ＰＣＲ在乳腺癌检测及治疗监测中的 应用，现报道如下。 ｌ资料和方法 １．１ 资料 搜集２０１１年１２月至２０１２年３月，来本院就诊 并手术后经病理证实的乳腺癌患者４１例，病例均为 女性，取乳腺癌患者癌组织分别进行免疫组化和实 时定量ＰＣＲ。 １．２ 方法 １．２．１ 免疫组化方法（ＩＨＣ）：４１例病理标本取材 后，经１０％中性甲醛固定、组织脱水、二甲苯透明、 石蜡包埋切片，行ＨＥ染色、弹力纤维染色和免疫组 织化学染色，标志物为Ｈｅｒ－２、ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６，光学显 微镜下观察免疫组化检测结果。抗体表达于细胞 膜、细胞质或细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒者为阳 性细胞。每例切片阳性细胞数占同类细胞数的 １０％以上者视为阳性。 １．２．２实时定量ＦＣＲ：提取癌组织ＲＮＡ，将４１例 标本按顺序从１排到４１号，分别将癌组织放在液氮 中研磨成粉末后，按每５０ ｍｇ组织加入１ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ 进行裂解。室温静置５ ｍｉｎ，按照２００ ＩｘＬ氯仿７１ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ的比例加人氯仿，剧烈振荡１５ Ｓ，使其充分混 合，室温静置５ ｍｉｎ后，４℃、１２ ０００×ｇ离心１５ ｍｉｎ。 离心后混合物分为３相。将上层水相移至另外１个 １．５ ｍＬ离心管中按０．５ ｍＬ异丙醇／１ ｍＬ Ｔｆｉｚｏｌ的 比例加入异丙醇，充分混匀后室温静置１０ ｍｉｎ，然后 ４℃、１２ ０００×ｇ离心１０ ｍｉｎ。ＲＮＡ在底部和侧面形 成白色的小团沉淀。移去上清。在１．５ ｍＬ离心管 中按１：１加入７５％乙醇，来回颠倒混匀后，４℃、 １０ ６００×ｇ离心５ ｍｉｎ，小心弃上清。室温静置ｌ０ ０．５ Ｌ、５×ＰｒｉｍｅＳｃ￣ｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ｆｏｒ Ｒｅ，ａｌ Ｔｉｍｅ）２ ＩｘＬ、 ＰｒｉｍｅＳｃｆｉｐｔ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘｌ ０．５ ｔｘＬ，最后加ＤＥＰＣ 水定容至２０ ＩｘＬ。２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ Ｓ，于ＴａＫａＲａ 基因扩增仪上３７℃１５ ｒａｉｎ、８５ ｏＣ ５ Ｓ，逆转录反应 后将ｃＤＮＡ产物立即用于ＰＣＲ。 ＰＣＲ引物设计及验证：引物序列如下：人ＣＫＳ／ ６，上游序列５ 一ｃＧＧＴＡＧＴＧＧＡ ＴｒＧＧ ＴＩ’ＣＧ一３ ，下 游序列５ ．Ｇ１ＴｒＣＴＧＣＣＴＣＡＣＡＧＴＣｒＩＴＧＧ一３ ；人Ｈｅｒ．－２， 上游序列５ ．ＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣ一３ ，下游 序歹Ｕ ５ －ＧＡＴＣＣＣＡＣＧＴＣＣＧＴＡＧＡＡＡＧ－－３ ；人ＥＧＦＲ， 上游序列５ 一ＡＡＴｃｃｃＡＴｃＡｃｃＡＴｃ，ｒＩ’ｃｃ一３ ，下游序 列５ ．ＡＧＧＴＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＣＡＡＡＣＧ一３ ；人ＧＡＰＤＨ， 上游序列５ ．ＡＧＧＴＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣＣＡＡＡＣＧ－３ ，下游 序列５ ．ＣＡＴＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧ１［］【ＴｒＣＣ．－３ ；所得基因序列 在Ｇｅｎｅｂａｎｋ网上数据库中查询并通过ＢＬＡＳＴ比较 分析。 ＥＲ扩增：取灭菌且无核酸酶的０．２ ｍＬ ＥＲ 反应管，在冰上依次加入２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ １２．５ Ｌ，上下游引物、ｃＤＮＡ各１ Ｌ、无核酸酶超纯 水补至２５ Ｌ。２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ Ｓ，于ＴＡＫＡＲＡ 基因扩增仪进行扩增反应。程序设置９４℃预变性 ３ ｍｉｎ，循环１次，９４℃变性３０ Ｓ－，５５ ｏＣ退火３０ｓ、７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０个循环后，总延伸７２℃２ ｍｉｎ。扩 增产物立即用于琼脂糖凝胶电泳。 琼脂糖凝胶电泳：制备琼脂糖凝胶：用０．５× ＴＡＥ缓冲液配制１％琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热 使之沸腾，冷至５５℃将其注入模具中备用。样品预 染及加样：取１ ＩｘＬ预染液Ｇｅ１．ｄｙｅ，与ＰＣＲ产物混 合，然后加样。恒压电泳，每１０ ｍｉｎ置于投射紫外 灯下观察，约４０ ｍｉｎ后在凝胶成像系统下观察电泳 结果，并拍照留底。 １．３统计学分析 基因表达情况所得数据采用卡方检验，应用 ＳＰＳＳ １０．０软件进行分析。Ｐ＜０．０１为差异有统计 学意义。 第１期 陈颖，等．免疫组化和ＰＣＲ检测乳腺癌Ｈｅｒ－２、ＥＧＦＲ和ＣＫ５／６过表达水平用于乳腺癌疗效的评估 ５９ ３讨论 人表皮因子受体２（Ｈｅｒ－２）是和乳腺癌发生发 展密切相关的癌基因。其扩增或过表达的患者复发 转移早，无病生存期短，预后效果差，作为乳腺癌十 分重要的疾病预测因子和靶向治疗位点，对指导治 疗和预后评估意义重大，因此，准确评估乳癌患者的 Ｈｅｒ－２状态至关重要；表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）是 位于细胞膜的蛋白激酶受体，对维持细胞生长、增殖 等起关键作用。ＥＣＦＲ过度激活可以促使恶性肿瘤 细胞增殖、血管生成，促进转移、抑制凋亡…。在近 年抗肿瘤分子靶向研究中，ＥＣＦＲ是关注最为广泛、 研究最为深入、也是最有前途的治疗靶点之一。上 皮特异性标志物ＣＫ ５／６（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ５／６），它是上 皮源性肿瘤细胞骨架的组成成分，它属于一个多基 因家族，其成员超过３０种，研究表明，ＣＫ在间叶组 织（外周血、骨髓、淋巴结等）中无表达，而在上皮性 肿瘤组织（乳腺癌、宫颈癌、肺癌等）中有表达，而 ＣＫ５／６由于其高度的上皮组织特异性以及乳腺癌细 胞中的广泛表达成为检测乳腺癌患者肿瘤细胞的一 个最常用的指标。本实验选取这３种易感基因从对 乳腺癌的指导治疗、预后评估、靶向治疗和广泛转移 等方面进行评估，为乳腺癌评估的有效手段做出合 理科学的依据。 目前，检测Ｈｅｒ。２、ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６等乳腺癌易感 基因的主要方法包括免疫组织化学、荧光原位杂交 （ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）和色素原 位杂交（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＣＩＳＨ）、组 织ＰＣＲ检测方法等。其中，ＩＨＣ操作简单易行，结 果判读方便，费用低廉，耗时短，适用于临床的广泛 使用，但此法易受组织标本的处理，固定时间，观察 者的主观判断和结果解释等存在较大差异；聚合酶 链ＰＣＲ技术是近年来一门新兴发展的实验技术，其 敏感性高，包括测量ｍＲＮＡ的表达水平，ＤＮＡ的拷 贝数目等 引。已有研究对实时聚合酶链ＰＣＲ技术 检测Ｈｅｒ－２、ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６等乳腺癌易感基因的扩增 状态的准确性和ＩＨＣ方法进行了比较，结果表明实 时聚合酶链ＰＣＲ检测Ｈｅｒ．２、ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６等乳腺 癌易感基因的状态是准确可信的，其与ＩＨＣ的符合 率可达为９ｌ％ ，本实验结果显示，３组基因比较 ＰＣＲ技术的敏感性要远高于免疫组化，总体显示率 具有一致性，因ＲＴ—ＰＣＲ技术耗时长，费用较高，操 作难度较大，在ＲＮＡ的提取、引物探针的设计以及 实验的操作等都标准化程度还不够，使该项技术还 未能在常规实验室开展。相对ＩＨＣ，ＰＣＲ检测方法 更能反映Ｈｅｒ－２、ＥＧＦＲ、ＣＫ５／６等乳腺癌易感基因扩 增状态 Ｊ，这也与本实验结果相一致。 ［参考文献］ ［１］ＮａｌｗｏｇａＨ，Ａｍｅｓ ＪＢ，ＷａｂｉｎｇａＨ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＥＧＦＲ ａｎｄ ｃ—ｋｉｔ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｓａｌ—ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｅａｒｅｉｎｏ— ｍａｓ ｏｆ Ａｆｉｒｃａｎ ｗｏｍｅｎ［Ｊ］．ＡＰＭＩＳ，２００８，１１６（６）：５１５－５２５． ［２］ Ｂｅｒｇｑｖｉｓｔ Ｊ，Ｏｈｄ ＪＦ，Ｓｍｅｄｓ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｍｉｃｍａｒｒａｙ—ｂａｓｅｄ ＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲ２ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｕｔｃｏｍｅ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ，２００７，１８（５）：８４５－８５０． ［３］ＩｇｎａｔｉａｄｉｓＭ，ＫａｌｌｅｒｇｉＧ，ＮｔｏｕｌｉａＭ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｉｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｕｌｔｉｍａｒｋｅｒ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １９，ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ Ａ，ａｎｄ ＨＥＲ２ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｂｒｅｓａｔ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００８， １４（９）：２５９３－２６００． ［４］ Ｃｕａｄｒｏｓ Ｍ，Ｔａｌａｖｅｒａ Ｐ，Ｌ６ｐｅｚ ＦＪ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎａｌ－ ｙｓｉｓ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｅｒ２／ｎｅｕ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］． Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，７７（１）：３８－４５． ［５］Ｓｕｏ Ｚ，Ｄａｅｈｌｉ ＫＵ，Ｌｉｎｄｂｏｅ ＣＦ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｑｕａｎｔｉｌｆｃａ． ｔｉｏｎ ｏｆ ｃ—ｅｒｂＢ－２ ｇｅｎｅ ｉｓ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｆｏｒ ＦＩＳＨ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎ— ａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ， ２００４，１２（４）：３１１－３１８． ［６］ Ｂａｒｂｅｒｉｓ Ｍ，Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ Ｃ，Ｃａｎｎｏｎｅ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｑｕｎａｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ＨＥＲ２ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｏｓｔ－ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ・－ ｎｅｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，２００８，１２９（４）：５６３－５７０．
