分子诊断学

分子诊断学：以分子生物学理论为基础，利用分子生物学技术和方法研究人体内/外源性生物大分子体系的存在、结构或表达调控变化，为疾病的预防诊断治疗和转归提供信息和依据。

基因：能够表达和产生蛋白质的RNA的DNA序列，是决定遗传性状的功能单位。

基因组：细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。

端粒：以线性染色体形式存在于真核基因组DNA末端的一种特殊结构。

操纵子：操纵基因与其控制下的结构基因共同组成的功能单位。

断裂基因：指基因的内部存在间隔区，间隔区的DNA序列与该基因所决定的蛋白质没有关系。间隔区又称为内含子。出现在成熟RNA中的有效区段称为外显子。

重叠基因：指基因的开放阅读框存在一个或多个核苷酸重叠的基因。

假基因：基因家族中有的成员因突变失活，不能表达出有活性的产物。

顺式作用元件：是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。

反式作用因子：是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。

启动子：是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。

增强子：位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列。

SNP：是指单个核苷酸变异而形成的DNA分子多态性。根据SNP在基因组中的位置，可分为编码区SNP（cSNP）、基因周边区SNP（pSNP）、基因间SNP（iSNP）。

转座因子/可转座元件：能在基因组中从一个位点移至另一个位点的DNA序列。

基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。

受体：存在靶细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而发生生物学效应的特殊蛋白质。

分子克隆：在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖。

蛋白激酶：指能够将磷酸基团从磷酸供体分子转移到底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。

蛋白磷酸酶：是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。

基因工程：有目的的通过分子克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系

列过程。

DNA重组：将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键将末端连接形成重组DNA。

载体：能在连接酶作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。

克隆载体：能将目的基因在受体细胞中复制扩增并产生大量目的基因的载体。

表达载体：能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。

穿梭载体：能够在两类不同宿主中复制、扩增和选择的载体。

转化：质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。最常用细菌是大肠杆菌。

感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。

转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。

转染；指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。

DNA变性：在物理或化学因素作用下两条DNA链间的氢键断裂，而共价键则不受影响。

DNA复性：当变性因素解除后，两条DNA链又可通过碱基互补配对形成DNA双螺旋结构。

核酸探针：能与特定靶基因序列发生特异性互补结合，并可用特殊方法检测的被标记的已知核苷酸序列。

退火：指将温度降至引物的Tm值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合形成杂交链。

平台效应：PCR反应中，当引物-模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化反应趋于饱和，即PCR反应产物不再增加。

基因打靶：通过DNA定点同源重组，改变基因组中某一特定基因，从而研究此基因的功能。

基因芯片：指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的样本杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。

错义突变：DNA分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由于它所编码的氨基酸就变成另一种的氨基酸，使得多态链中的氨基酸顺序也相应的发生改变的突变。

无义突变：由于碱基对的取代使原来可以翻译某种aa的密码子变成了终止密码子的突变。

同义突变：有时虽然碱基被取代，但在蛋白质水平上没有变化，aa没有被取代，这是因为突变后的密码子和原来的密码子代表同一个aa的突变。

移码突变：在编码序列中，单个碱基、数个碱基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突变位点之后的三联体密码阅读框发生改变，不能编码原来的蛋白质的突变。

癌基因：细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在诱导细胞恶性转化的特性。当癌基因结构或表达发生异常时，其产物可使细胞无限制增殖，导致肿瘤的发生。

细胞癌基因：与病毒基因组有同源序列，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。在正常细胞内未激活的细胞癌基因叫原癌基因。

病毒癌基因：存在于病毒（大多是逆转录病毒）基因组中能使靶细胞发生恶性转化的基因。

基因诊断：以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、结构缺陷或表达异常，对人体的状态和疾病做出诊断的方法和过程。基因治疗：一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗方法。

RFLP：即限制性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。若因此改变了RE的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化。

反义RNA：碱基序列正好与有意义的mRNA互补的RNA。

三链DNA：当某一DNA或RNA寡核苷酸与DNA高嘌呤区可结合形成三链，能特异的结合在DNA的大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成氢键。

SSCP：单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构像就不同，这样就形成了单链构象多态性。

细胞的全能性：指同一生物的所有细胞都含有相同的DNA，即基因的数目和种类是一样的，但在不同阶段，同一个体的不同组织和器官中基因表达的种类和数目是不同的。

SD序列：转录出的mRNA要进入核糖体上进行翻译，需要一段富含嘌呤的核苷酸序列与大肠杆菌16S mRNA3，末端富含嘧啶的序列互补，是核糖体的识别位点。

反义核酸技术：是通过合成一种短链且与DNA或RNA互补的，以DNA或RNA为目标抑制翻译的反义分子，干扰目的基因的转录、剪切、转运、翻译等过程的技术。

周期蛋白：是一类呈细胞周期特异性或时相性表达、累积与分解的蛋白质。

CAP：是大肠杆菌分解代谢物基因活化蛋白，这种蛋白可将葡萄糖饥饿信号传递给许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖时可以利用其他碳源。

结构域：pro或核酸分子中含有的与特定功能相关的一些连续或不连续的aa或核苷酸残基。

分子诊断学主要任务利用基础医学和生命科学理论和方法探讨疾病的发生发展和转归的分子机制；为整个疾病过程寻求准确特异的分子诊断指标；利用分子生物学技术为这些分子诊断指标建立临床实用可靠的检测方法。应用：诊断感染性疾病，遗传病，肿瘤，个体化医疗。

病毒、原核、真核基因组的特点①病毒基因组：种类单一；单倍体基因组；形式多样；

大小不一；基因重叠；动物/细菌病毒与真核/原核基因相似：内含子；具有不规则的结构基因；基因编码区无间隔；无帽状结构；结构基因没有翻译起始序列。②原核基因：为一条环状双链DNA；只有一个复制起点；具有操纵子结构；绝大部分为单拷贝；可表达基因约50%，大于真核生物小于病毒；基因一般是连续的，无内含子；重复序列很少。③真核基因组：结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；基因组DNA与蛋白质结合成染色体，储存于细胞核内；真核基因为单顺反子，而细菌和病毒的结构基因为多顺反子；基因组中非编码区多于编码区；真核基因多为不连续的断裂基因，由外显子和内含子镶嵌而成；存在大量的重复序列；功能相关的基因构成各种基因家族；存在可移动的遗传因素；体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。

真核基因组分为细胞核基因组和细胞器基因组，后者较少，存在于真核细胞的线粒体和叶绿体中。几乎所有真核生物都有线粒体基因组，所有能进行光合作用的真核生物都有叶绿体基因组。细胞器基因组多为环状单链DNA，少数为线状DNA。

质粒核酸有的是DNA，有的是RNA，多数为共价闭合环状DNA(cccDNA)，少数为线状DNA。

原核生物的转座因子可分为插入序列IS、Tn和可转移性噬菌体。

病毒基因组的结构：帽子和polyA尾结构；粘性末端；末端正（反）向重复序列；重叠基因；分段基因组；LTR。

人类DNA分子多态性产生方式①重复序列单元的拷贝数变异，主要是微卫星DNA多态性。②转座因子导致的分子多态，如Alu序列多态性。③单个核苷酸的变异SNP。

受体特点：高度专一性、高度亲和性、可逆性、可饱和性、特定的作用模式。

分子克隆基本步骤①目的基因的获取②载体的选择③目的基因和载体酶切连接④重组DNA导入受体细胞⑤重组体的筛选和鉴定⑥目的基因的表达。

目的基因的获取方法从基因文库中获取、逆转录合成cDNA、人工合成以及直接从染色体DNA中分离。

分子克隆中常用的工具酶：限制性核酸内切酶RE、DNA聚合酶I、逆转录酶、DNA连接酶、碱性磷酸酶，T4多核苷酸激酶。

II型RE的作用：回文结构内特异性切割DNA产生粘性末端和平末端两类切口。RE错位切开DNA双链产生粘性末端；RE平齐切开DNA双链产生平末端。

DNA聚合酶包括：DNA聚合酶I（①5`→3`聚合酶活性②3`→5`核酸外切酶活性③5`→3`核酸外切酶活性）、TapDNA聚合酶（①5`→3`聚合酶活性②5`→3`外切酶活性）、逆转录酶（①依赖RNA的DNA聚合酶活性②3`→5`RNA外切酶活性③DNA指导的DNA聚合酶活性）

DNA连接酶主要有2种：大肠杆菌DNA连接酶（只能连接粘性末端）和T4噬菌体DNA连接酶（既能连接粘性末端也能连接平末端）

碱性磷酸酶应用：除去DNA片段上的5’磷酸，以防止自身连接；在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前除去RNA或DNA上5’磷酸，以便进一步用32P标记的γ-磷酸重新磷酸化，使5’端被32P标记。

分子克隆的载体：包括克隆载体和表达载体，常用载体有质粒，噬菌体，粘粒，酵母质粒和病毒等。噬菌体载体：以λ噬菌体、M13和粘粒最为常用。非必需区域：可被外源DNA片段代替而不影响λ噬菌体的生存。λ噬菌体5`端含12核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称为cos位点。粘粒载体由质粒和λ噬菌体的cos位点组成。

载体的条件有自身的复制子、有RE酶位切点，即多克隆位点，以供外源DNA插入、有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子、有足够容量、可通过特定的方式导入细胞、对于表达载体还应具备与宿主细胞相应的DNA调控元件。

质粒载体：1.pBR322~：①组成：来源于ColE1的派生质粒pMB1的复制起始位点（ori）、来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性（Ampr）、来源于pSC101质粒的四环素抗性（Tetr）。②特点：有一个复制起始位点；有两个抗生素抗性基因做选择标记和数个单一的限制性酶切位点（双抗生素筛选法）；分子量较小，拷贝数较高。2.pUC18、19~：①组成：来自pBR322质粒的ori、Ampr基因（但DNA序列已不含有原来的RE识别位点）、lacZ’基因、MCS。②优越性：分子量更小拷贝数更高，适用于组织化学筛选重组体（蓝白斑试验）。

蓝白筛选的原理：某些质粒带有大肠杆菌半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lacZ基因活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。这种颜色标志使重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。

原核生物基因表达特点：只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子；以操纵子为单位；转录与翻译是偶联连续进行的；一般不含有内含子，因此真核基因的内含子在原核细胞中转录后不能被切除；转录是原核生物基因表达调控的主要环节。

真核生物基因表达特点：调控环节多，转录与翻译间隔进行，真核生物活性染色体结构的变化有调控作用，正性调节占主导。原核基因在原核细胞中表达较少，真核基因既可选择真核细胞也可选择原核细胞表达。

真核细胞表达外源基因的条件：①首先必须具备哺乳动物细胞表达的功能元件，要求哺乳动物细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件②注意选择转染的受体细胞，不同类型的细胞具有不同的特性；③注意选择适当的选择标记。

核酸分子杂交的原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链，在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。

影响杂交的因素：核酸分子的浓度和长度、温度、杂交液离子强度和甲酰胺浓度、杂交率、洗涤条件、促进剂。

各种固相杂交方法检测目的：Southern印迹杂交：→凝胶电泳膜上的DNA；Nouthern印迹杂交→凝胶电泳膜上的RNA；菌落杂交→膜上经裂解由菌落释放出DNA；斑点杂交或狭缝杂交→固定在膜上的DNA或RNA分子；原位杂交→细胞或组织中的DNA或RNA分子。

Southern印迹杂交：指经凝胶电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定固相支持物上，然后用标记的探针DNA分子检测靶DNA的方法。基本过程包括：限制性核酸内切酶消化待测DNA→琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段→DNA变性并转印到固相支持物上→预杂交→与特异DNA探针杂交→杂交信号的检测及结果分析。

探针的种类和优缺点：①cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的探针。②基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化。切取插入片段，分离纯化为探针。③寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。④RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或翻译RNA作为探针。

探针的标记法：①缺口平移法：此法是利用适当的浓度的DNase I在DNA双链上随即切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下，以互补的DNA单链为模板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链，同时DNA聚合酶I的5-3的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。②随即引物法：随即引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段。将这些引物于变性的DNA单链结合后，以4种dNTP(其中一种是标记物标记的ddNTP)为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。③PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就在PCR反应的同时渗入到新合成的DNA链上。④末端标记法：只是将DNA片段的一段进行标记

理想探针标记物应具备的特征：高灵敏度，标记物与探针结合后不影响碱基配对的特

异性，杂交体的稳定性及其Tm值，检测方法灵敏度高，特异，假阳低，标记物与探针结合后稳定，保存时间长，标记物对环境无污染，对人体无伤害，价格低廉。

PCR基本原理：依据细胞内DNA半保留复制的机理以及体外DNA分子在不同温度下双链和单链可以相互转变的性质，人为控制温度以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行就可使目的DNA得以迅速扩增。

PCR反应体系：①模板：来源于任何生物的DNA或RNA，经逆转录为cDNA。②dNTP：4种浓度应相等。③引物：人工合成的一对可以分别与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序列。④DNA聚合酶：是Mg2+依赖性酶。⑤缓冲液：含KCl，Tris-Cl、Mg2+。

PCR引物设计原则：①引物长度为15-30个核苷酸。②引物的均衡性：碱基尽可能随即，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。③引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。④引物的特异性：与非特异性扩增区的序列的同源性不超过70%，3’末端不应有连续8个碱基与非目的基因同源。⑤引物3末端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DN配对。引物3末端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。

PCR反应动力学：刚开始PCR产物以指数形式增长，到了后期由于DNA聚合酶活性降低，原料不断消耗，反应中出现一些焦磷酸抑制其扩增，逐渐变为线性增长直至出现平台效应。

温度循环参数：①变性温度与时间：94℃30S；②复性温度与时间：低于引物Tm5℃；③延伸温度与时间：72℃；④循环数和扩增效率：25-30次左右为佳。

PCR的优化：①降落PCR（TD-PCR）：即梯度PCR，根据引物Tm，选定一个退火温度范围，在每一个退火温度上循环2-5次。②热启动PCR：提高PCR反应特异性。

PCR常见问题原因分析及处理：①假阳性：PCR产物污染，含有靶DNA序列的质粒污染，阳性对照污染，标本交叉污染等均可造成假阳。可通过优化PCR条件，巢式PCR，PCR产物的序列分析等方法加以解决。②假阴性：靶DNA丢失，模板降解，DNA酶失活，Mg2+浓度过低，仪器故障，电泳误差等均可造成假阴。提高PCR反应特异性：扩增引物设计时选择特征性强的序列，使用较纯的引物，较低浓度的引物、酶、Mg2+，尽量使用较高的退火温度，较少的循环次数，纯度和浓度较高的DNA模板，必要时使用提高特异性的添加剂。

PCR衍生技术：①巢式PCR：使用2对引物，一对引物序列在模板的外侧，用于扩增含目的基因的大片段，另一对引物序列在模板内侧，用于扩增目的基因。②逆转录PCR：检测RNA病毒、mRNA时，一般不能以RNA为模板直接扩增，应用RT-PCR对RNA进行分析使敏感度提高。先将RNA用逆转录酶转录成cDNA，然后加入特异引物对目标片段进行扩增。③多重PCR：也称复合PCR，是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段。④原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程。⑤定量PCR：QPCR，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板进行定量的技术。

荧光定量PCR：FQ-PCR，基于荧光能量传递技术，通过对PCR扩增反应每个循环结束时产物荧光信号的监测，对起始模板进行定量分析。荧光扩增曲线分为荧光背景信号阶

段、荧光信号指数扩增阶段、荧光信号扩增平台期三个阶段。常用技术有荧光染料法和荧光探针法。

常见的核酸扩增技术按温度条件可分为温度循环系统和等温扩增系统。前者主要包括PCR和LCR，后者主要为bDNA。

临床基因扩增检验试验室的规范化设置：试剂贮存和准备区＞40cm2；标本制备区＞10cm2；扩增区＞6cm2；产物分析区＞15cm2。四个区域必须相互独立；各区的仪器设备及物品必须专用；各区不能直通，应设有缓冲间；产物分析区应安装抽风装置。

SANGER双脱氧链终止法测序原理：DNA链中核苷酸以3’5’—磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是2’—脱氧核苷三磷酸。2’3’ddNTP与普通dNTP不同，他们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dDTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异性的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。

化学降解法M&G法测序原理：首先对待测双链或单链DNA作末端放射性标记，标记后的DNA分成4组，分别用不同的化学试剂对不同的碱基进行特异性的化学切割，通过控制化学反应条件，使碱基的断裂只随即发生在某一特定的位点，由此各组均产生不同长度的DNA片段，通过高分辨率的变形聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射显影检测后直接识读待测DNA的核苷酸序列。与Sanger相比，测序较短DNA片段无需将待测片段亚克

隆到测序载体上。

M&G碱基特异的化学切割：硫酸二甲酯→鸟嘌呤甲基化→G，甲酸→脱嘌呤作用→G和A，肼→嘧啶开环→C和T，肼→胞嘧啶开环→C。

待测DNA的末端标记：①以T4噬菌体多核苷酸激酶和γ-32P-ATP标记待测DNA的5’端；②以末端转移酶和α-32P-dNTP标记待测DNA的3’端；③以Klenow片段和α-32P-dNTP标记待测DNA的3’-凹进末端。

焦磷酸测序技术基本原理：测序引物与单链DNA模板退火后，通过DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等四种酶的次级反应，将每一个dNTP的掺入与一次荧光信号的释放偶联起来，以荧光信号的形式实时记录DNA模板的核苷酸序列。

HBV病毒基因组结构：①不完全双链环状结构②利用重复的开放读码框架ORF可编码多个蛋白质，一个ORF可转录两种RNA：前基因组RNA和C-mRNA。一种mRNA可编码两种蛋白质③所有调控序列均位于蛋白质编码区④基因序列具有多变性。

HIV病毒基因组结构：属逆转录病毒，该科病毒带有以RNA为模板合成DNA的逆转录酶。HIV颗粒的核心有2个拷贝的单股正链RNA，2个单体通过5’端的氢链结合形成二聚体。每个RNA的长度约为9.7Kb。其5’端有一帽子结构，3’端polyA尾。HIV基因组的结构和组合形成与其他逆转录病毒相同，从5’端至3’端依次为LTR、gag、pro、pol、env和LTR。

TB细菌基因组结构：TB H37Rv株基因组是环状双链DNA。从基因组序列分析代谢

途径，可发现TB的某些代谢途径与其他细菌很不同，TB具有合成所有必须aa、维生素和酶辅因子的潜在能力。

Hb病：分为两类，一类是由于珠蛋白一级结构变化所导致的异常血红蛋白病，另一类是由于珠蛋白多肽链的组成比例改变和珠蛋白含量降低所导致的地中海贫血。

珠蛋白基因簇的结构：人Hb基因簇包括α珠蛋白基因簇和β珠蛋白基因簇，用于发育早期Hb的表达基因位于基因簇5’端，用于发育晚期Hb的表达基因位于基因簇3’端。

镰状细胞贫血的分子诊断：由于β珠蛋白基因错义突变引起的疾病。针对β珠蛋白基因的第5、6、7位密码子进行PCR扩增，扩增产物用MstⅡ限制性内切酶进行酶切，通过对酶切片段电泳分析或Southern杂交可作出正确诊断。

地中海贫血分子诊断：由于组成Hb的某种肽链的合成速率降低，而另一种珠蛋白链的合成相对过剩，导致该类红细胞中的Hb四聚体组成和结构发生变化，进而引起HA。

核酸分离制备总原则：保证核酸一级结构完整性；尽量排除其他分子污染，保证核酸的纯度。

核酸提纯的主要步骤：细胞裂解；抽提分离；核酸纯化；核酸鉴定。

核酸制备的影响因素：实验过程中应尽量减少下列因素对核酸的裂解作用,在操作过程中简化步骤，缩短时间；化学因素，控制PH4-10；物理因素，机械剪切力包括剧烈的溶液振荡搅拌，低渗溶液及反复冻融等引起的DNA的裂解；生物因素，各种核酸酶能消化核酸的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。

蛋白酶K-酚抽提法：①原理：将真核组织细胞破碎，用组织细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀DNA,可得到基因组DNA片段。②试剂用途：蛋白酶K能水解蛋白质，消化DNA酶，DNA上的蛋白质及裂解细胞。EDTA-Na2为二价金属离子螯合剂，可抑制Dnase的活性，同时降低细胞膜的稳定性。SDS为银离子去污剂，能引起细胞膜降解，乳化直脂质和蛋白质，沉淀蛋白质，同时可以降解DNA酶。RNA酶可以水解RNA以获得高纯度的DNA。酚可使蛋白质变性沉淀并抑制DNA酶活性。三氯甲烷能加速有机相和水相的分离。异戊醇可减少在抽提过程中由于蛋白质变性产生的大量气泡。PH8.0的Tris缓冲液可使抽提后的DNA进入水相，避免滞留在蛋白质层。

NaI法提取人血DNA：在低渗的双蒸馏水中，血液中的红细胞膜及白细胞膜被破坏，释放出Hb及细胞核。加入NaI后破坏核膜并解离DNA-蛋白质复合物，使DNA以游离形式存在，易于提取，再以三氯甲烷-异戊醇抽提使蛋白质变性沉淀并溶解脂质，离心后DNA存在于上层水相中，用37%异丙醇沉淀DNA，弃去上清液，重复操作一次，即可获得白细胞DNA。水相DNA在偏碱性环境中带负电荷，在电场作用中受到电场力的作用向正极运动，由于凝胶的分子筛作用以及DNA分子大小和构象不同使其迁移速度不同，用凝胶电泳坚定DNA。

碱裂解法提取质粒DNA：基于DNA的变性与复姓差异而达到分离目的。将细菌悬浮于葡萄糖等渗溶液中，经EDTA、NaOH-SDS溶液处理，可破坏细菌细胞壁和细胞外模，使细菌崩解。NaOH破坏核酸碱基配对使氢键断裂，细菌染色体DNA、大分子DNA以及SDS-蛋白质-细胞膜复合物缠绕在细胞壁碎片上，冰浴后易沉淀，可离心除去，而质粒DNA及细菌中的可溶性蛋白质，核糖核蛋白体和tRNA等留在上清中。通过加入蛋白水解酶和核糖核酸酶可以分解之。通过碱性酚或酚-三氯甲烷-异戊醇等有机溶剂除去蛋白质、再用乙醇等有机溶剂沉淀DNA，即可得到纯化的质粒DNA。

异硫氰酸胍-酚-三氯甲烷一步法提取RNA：强变性剂异硫氰酸胍能迅速裂解细胞，释放RNA，使RNA与核蛋白解离。同时，高浓度的异硫氰酸胍和β-硫基乙醇还可迅速使细胞内的Rnaes失活，保护RNA不被降解。酸性条件下，酚-三氯甲烷抽提RNA进入水相，DNA、蛋白质和脂类则存在于酚相。上层水相经异丙醇沉淀和乙醇洗涤可获得纯化的总RNA。

琼脂糖水凝胶电泳：带电粒子在电场中向与其自身电荷相反电极的运动称为电泳。琼脂糖凝胶电泳使用琼脂糖作为支持介质的一种电泳方法。主要原理为分子筛效应和电荷效应的联合应用。琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其相互盘绕形成绳状琼脂束，构成细微多孔的网状结构。不同的DNA分子因其所带的电荷数、分子量及分子构象不同，在同一电场中的迁移率不同，从而可以达到分离DNA的目的。影响因素：核酸样品的性状，包括分子的大小，电荷多少，颗粒形状和空间结构（超螺旋移动最快）；琼脂糖浓度；电场强度，通常需小于5V/cm；染料，常用溴化乙锭EB；离子强度的影响。另外电泳过程中常用有颜色的标记物指示样品的迁移过程，常用溴酚蓝Bb和二甲苯青Xc，指示剂通常加在上样缓冲液中，还要加入适量的甘油、蔗糖和聚蔗糖增加相对密度。