高效液相色谱法测定保健品中维生素d含量

高效液相色谱法测定保健品中维生素D含量

□ 罗　骁　吴帅龙　李彩玲　广电计量检测（合肥）有限公司

摘　要：建立了一种使用液相色谱-紫外检测器，以维生素D2、D3互为内标，测定保健食品中维生素D的方法。样品经淀粉酶水解，无水乙醇-氢氧化钾皂化，皂化液用石油醚萃取、水洗、干燥，旋转蒸发至约2 mL，氮吹至干，甲醇溶解定容，内标法定量。维生素D2和维生素D3的分离度为1.5，线性范围为0.01～5.0 μg/mL，相关系数R2≥0.999；相对标准偏差RSD（n=6）为2.82%～5.10%；加标回收率96.23%～104.26%。当取样量为5.000 g时，VD2、VD3的检出限均低于0.2 μg/100 g。

关键词：维生素D；保健食品；液相色谱（HPLC）；内标法维生素D3与维生素D2为脂溶性

二极管阵列检测器，Shimadzu）。

品牌保健食品（片剂，打磨成均匀粉

维生素，主要功用是调节细胞生长分化和人体免疫功能，有利于新骨生成疏松症。但维生素D摄入过多，可引素D3的含量有着重要意义。

起高血钙、甚至软组织异位骨化等[2]。

和钙化，促进骨骼生长[1]，预防骨质因此准确、方便测定保健食品中维生色谱法（HPLC-UV）和液相色谱-质

维生素D的分析多采用高效液相

抗坏血酸（山东西亚，GR，99.5%）， 正己烷石油醚（30～60 ℃），无水硫酸钠，甲醇，淀粉酶（活力单位≥100 U/mg）。1.2　色谱条件

维生素D3（BePure，99.3%±1%），

维生素D2（BePure，98.0%±2%）， 状，过筛）5.000 g试样于平底烧瓶中，加入温水和1.00 mL浓度为1 μg/mL60 ℃恒温水浴振荡40 min，酶解液中依次加入1.0 g抗坏血酸、0.1 g BHT、的维生素D2标准溶液和1 g淀粉酶， 30 mL无水乙醇、20 mL氢氧化钾溶用20 mL×2石油醚萃取，合并醚层。水洗醚层至中性，经无水硫酸钠过滤，旋转蒸发至约2 mL，40 ℃水浴氮吹至干，加入1.0 mL甲醇溶解，微孔滤膜过滤，上机测定。

谱法。其中高效液相色谱法需要在酶解皂化反应后，采用正相色谱净化测定，前处理复杂、费时；液相色谱-影响其推广使用。本文使用维生素D2中维生素D3，测定维生素D2时，使用同位素内标，降低基质效应，提高了定量准确性。

质谱法具有高灵敏度、高通量及高选择性等特点，但设备和试剂价格昂贵，为内标，高效液相色谱法测定保健品维生素D3为内标，无需色谱净化，简化了操作步骤，维生素D2替代昂贵的

5 μm；流动相：甲醇+水=95+5；流速：1 mL/min；

nm；进样体积：50 μL。

1.3　标准品配制与样品处理

柱温：35 ℃；检测器波长：2 称取维生素D2、维生素D3标准品

色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，

液（50%），65 ℃回流皂化50 min，

2　结果与讨论

各10.0 mg，乙醇溶解定容至100 mL， 浓度为10 μg/mL，并转移至棕色试剂瓶待用。用流动相配制系列维生素D3工作标准溶液，分别加入0.05 mL维至10 mL。

生素D2标准溶液，95%的甲醇定容 过程对分析结果的准确性有决定性影

维生素D易于被氧化，样品处理

2.1　线性范围与定量限

生素D3）作为内标的系列浓度维生素内标法绘制标准曲线。同时，取空白

用加入了0.5 μg维生素D2（维

D2（维生素D3）标准溶液上机测定；样品，按“1.3”方法处理后，添加（S/N=3）确定其检出限，10倍信噪D的线性回归方程、相关系数（r2）、线性范围及检测低限结果见表1。

检出限μg/100 g0.190.1723维生素混合标准溶液，以3倍信噪比 比（S/N=10）确定其定量限。维生素

1　实验部分

1.1　仪器与试剂

Toledo），高效液相色谱仪（LC-20A，

维生素D2D3线性范围μg/mL0.01～5.00.01～5.0电子天平（十万分之一，Mettler-

响[3]。参照《食品安全国家标准 食

品中维生素A、D、E的测定》（GB

表1　线性方程、相关系数（r2）及定量下限

相关系数，r20.99990.99965009.82-2016）第四法，准确称量某

维生素D2、D3的分离度达到1.5，在定量限＜1.0 μg/100 g。灵敏度较高。2.2　精密度与准确度

实验结果表明，此方法条件下，线性方程C=1.0575A-0.0552C=1.3888A-0.4966一般市售保健食品中维生素含量，设定维生素的低、中、高3个维生素160 μg/100 g、240 μg/100 g，做加D2、D3添加水平分别为：80 μg/100 g、标回收实验，重复实验6次，同时考

实验结果表明，维生素D2、D3回察相对标准偏差（RSD），结果见表2。

收率在96.23%～104.26%，RSD为2.82%～5.10%。方法的精密度与准确度满足定量分析要求。2.3　实际样品检测

定量限μg/100 g0.65130.57430.01～5.0 μg/mL范围内具有良好的线性，相关系数（r2）均大于0.99，

使用厂家提供的空白样品，依据

健品（片剂）中的维生素D3进行测定，

（下转85页）

对7种市售称有增加骨密度作用的保

Oct. 2019 CHINA FOOD SAFETY 83分析与检测

3.1.1　合成标准不确定度ulgx=Slgxn()()1序号123456求和j

= =∑(lgx−lgx)i2n(n−1)3.1.2　扩展不确定度0.477 505=0.035 44820(20−1)1=19，由t分布可查得k=2.093；则U95置信概率为p=95%时的扩展不确定=0.074

由于置信概率p=95%，自由度v=20-

270210180380300290x1j

检测结果表2　一组样品的重复检测结果

lgx1j

检测结果对数值2.3622.4152.3802.4312.5312.519lgx2j

230260240270340330x2j

2.4312.3222.2552.5802.4772.462−lgx2.39652.36852.31752.50552.50402.4905残差平方和0.00238050.00432450.00781250.01110050.0014580.00162450.028700表3　lgxj的区间形式表示表

2.39652.27081903302.52222.49422.24283101702.3685

2.44322801602.3175

2.50552.37982404302.6312−lgx−lgx±0.125 7

xj范围

度U95=k× ulgx=2.093×0.0348

()2.19182.62972.37834302402.50402.49052.382304102.6162≤lgx≤2.550，取反对数，得252≤ x≤3。

3.1.3　不确定度报告

该被测样品菌落总数为252~ 分6次对6个不同时间获得的样

所以lgx=2.476±0.074，即2.402

确定度

3.2.2　两次检测平均值的标准不符合要求。排除这些因素后，可以看其他所有不确定度来源都可以忽略。参考文献

3 CFU/mL。

3.2　一组样品的重复检测

ulgx=Slgx=()()u(lgij)2出，菌落总数检测结果的发散性较大，重复检测结果差值达3倍，与其相比

=0.048 93.2.3　扩展不确定度扩展不确定度

品进行检测，每份样品重复检测两次，则第j个样品的检测结果分别为x1j和x2j。检测结果见表2。

3.2.1　样本标准差

621=5，由t分布可查得k=2.57，则可得u95=k×−ulgx=2.57×0.048 9=0.125 7

3.2.4　检测结果区间范围所在区间范围（见表3）。

根据lgxj计算每一样品的菌落总数本次实验对平板计数琼脂培养基、

取置信概率p=95%，自由度v=6-

[1]刘云国.食品卫生微生物学标准鉴定图谱[M].北京：科学出版社,2009.

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 47.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定[S].北京:中国标准出版社,2016.

[3]国家认证认可监督管理委员会.RB/T 151-2016 　食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南[S].2016.

作者简介：魏万彩（1990—），女，甘肃白银人，硕士，工程师。研究方向：食品微生物检测。

u(lgxij)=Sp(lgxij)∑∑(lgx = =（上接83页）维生素D2D3j=1i=1ij−lgxj)24　结果与结论

6(2−1)0.028 700 5=0.069 26(2−1)生理盐水、无菌袋、试管和吸管等做

了相应的空白验证，同时对洁净室臭氧灭菌效果进行了环境监测，结果均

VD3含量分布在67.53～172.42 μg/100 g。添加水平1测定值μg/100 g回收率%83.25104.0679.6799.58表2　维生素的加标回收率和相对标准偏差（n=6）RSD/%3.574.02添加水平2测定值μg/100 g回收率/%166.82104.26160.19100.12RSD/%2.823.933　结论

时，维生素D2、D3的定量限分别为 0.65 μg/100 g、0.57 μg/100 g，满足保健品中维生素D定量分析要求。参考文献

添加水平3测定值μg/100 g回收率/%230.9796.23236.0498.35RSD/%5.102.8632(10):10-12.

[3]王玉堂,迟涛,胡本涛等.婴儿配方粉中维生素A、D、E测定的关键影响因素研究[J].中国食品学报,2013,13(12): 232-236.

作者简介：罗骁（1978—），男，安徽桐城人，硕士，高级工程师。研究方向：化学分析。

Oct. 2019 CHINA FOOD SAFETY 器，内标法检测保健食品中维生素

实验建立了液相色谱-紫外检测

D2、D3含量的方法，两者分离度达到1.5在0.01～5.0μg/mL浓度范围内有良好线性，加标回收率为97.77% ～106.56%。当取样量为5.000 g

[1]杨春华.维生素D简介[J].中国实用医药,2009,4(3):249-250.

[2]张浩,黄琪仁,沈筱同等.维生素D缺乏与补充研究现状[J].上海医药,2011,

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