维普资讯 http://www.cqvip.com 微生物学杂志 ２００７年７月第２７卷４期ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ Ｊｕｌｙ ２００７ Ｖｏ１．２７ Ｎｏ．４ ７９ 放线菌的分子分类 张 妍，张建丽 ，牛宁昌 （北京理工大学生命科学与技术学院，北京１０００８１） 摘要在放线茵分类学研究中，最初是根据形态特征、生理生化特征等表观分类学特征进行研究。随着分 子生物学的飞速发展，放线茵的分类鉴定亦从传统的表型分类进入到各种基因型分类水平。分子分类在放线 茵分类研究中起到越来越重要的作用，目前放线茵的分子分类研究主要包括：Ｇ＋Ｃｍｏｌ％测定、ＤＮＡ杂交、核 酸结构分析以及ＤＮＡ指纹图谱分析等方面。 关键词放线茵，分子生物学，分子分类 中图分类号Ｑ９３９．１３ 文献标识码Ａ 文章编号ｌＯＯ５—７ｏ２１（２００７）０４—００７９—０４ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｌｉ，ＮＩＵ Ｎｉｎｇ—ｃｈａｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ￡ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。Ｂｅｌｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｕｃｈ ａｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ｃｕｈｕｒａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ ａｐ－ ｐｌｉｅｄ ｗｉｄｅｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ａｃｔｉ－ ｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ｈａｓ，ｃｏｍｅ ｕｐ ｔｏ ｖａｒｉｏｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｌａｓｓｉｉｃａｔｆｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｌａｓｓｉｉｃａｔｆｉｏｎ．Ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ。ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｘｏｎｏｍｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｇ＋Ｃｍｏｌ％，ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ－ ｉｎｇ，ｐｌａｙｓ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｘｏｎｏｍｙ ａ从１８７５年Ｃｏｈｎ发现放线菌至今已有１００多 年的历史，放线菌分类学作为微生物分类学的分 支学科得到了长足的发展，经历了经典分类，化学 分类，分子分类和多相分类４个时期。随着科学 技术的快速发展，尤其是分子生物学、细胞化学、 分子遗传学以及生物信息学的发展，放线菌分类 研究也从传统的表观型跨越到了分子水平。１９８１ 年Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ等根据１６Ｓ ｒＲＮＡ基因相似性，核 类在放线菌分类学研究中起到越来越重要的作 用。本文就目前放线菌分子分类中常用的方法及 其优缺点等进行简述。 １ ＤＮＡ碱基组成分析 ＤＮＡ碱基组成比例（Ｇ＋Ｃ ｔｏｏ１％）是典型的 基因指征之一，一般认为Ｇ＋Ｃｍｏｌ％在种内不超 过３％，在属内不超过１０％，相差低于２％时没有 酸杂交的结果，描绘了放线菌和其他生物之间的 系统发育树，用分子生物学手段对传统放线菌分 类体系进行了补充和发展，标志着放线菌分类学 分类学意义。放线菌属于高ＧＣ含量的生物，放 线菌的Ｇ＋Ｃｍｏｌ％变化最多不超过３０％。 Ｇ＋Ｃｍｏｌ％分析已成为放线菌鉴定的基本 分子分类（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｘｏｎｏｍｙ）时期的开始。而随 着分子生物学和遗传学研究的深入开展，分子分 方法，作为描述放线菌分类单位的特征之一。但 值得注意的是Ｇ＋Ｃｍｏ１％含量的分析主要用于分 收稿日期：２００７—０２—２５ 作者简介：张妍女，在读硕士。现从事放线菌分类学研究。 基金项目：国家自然科学基金项目（３０５７０００２）；北京市自然科学基金项目（５０６２０２４） ・通讯作者 维普资讯 http://www.cqvip.com ８０ 微生物学杂志 析不确定的分类单元，而不是用它去建立一个新 的分类单元。 Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｓｐａｃｅｒ Ｒｅｇｉｏｎｓ，ＩＳＲ）的进化速率比１６Ｓ ｒＲＮＡ大１０倍，在细菌的不同属种中拷贝数、碱 基排列顺序以及内含的ｔＲＮＡ基因的数量和种类 ２ 基于核酸杂交的分析 ２．１ ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性分析 ＤＮＡ．ＤＮＡ同源性常用于亲缘关系密切的微 均不同，其序列大小比１６Ｓ ｒＲＮＡ更具直接测序 优势，通过ＰＣＲ后电泳显示ＩＳＲ多样性和序列分 析可鉴别细菌属与种 。但是１６Ｓ～２３Ｓ ｒＲＮＡ 生物种内相似性描述。它在检测错分菌株以及新 的不同拷贝之间大小比较相近且不易区分，需要 描述的菌株划归已有分类单元时非常有用。ＤＮＡ 的杂交值可反映出两基因组间序列的相似性；已 经证明，每错配Ｉ％，杂交热稳定性降低Ｉ％～ ２．２％。１９８７年，国际系统细菌学委员会规定， ＤＮＡ同源性≥７０％或杂交分子的热解链温度差 ≤５℃为细菌种的界限。在放线菌分类中，ＤＮＡ． ＤＮＡ分子杂交已被确定为建立新种的必要依据 之一。目前ＤＮＡ．ＤＮＡ分子杂交的方法主要有固 相膜杂交…、液相复性速率法 等。 ２．２ ＤＮＡ－ｒＲＮＡ同源性分析 在进化中，ｒＲＮＡ分子的功能几乎保持恒定， 而且其分子排列顺序在有些部位变化非常缓慢， 保留了祖先的一些序列，即其序列比ＤＮＡ更保 守。因此ＤＮＡ同源程度很低的２种微生物在 ＤＮＡ．ｒＲＮＡ杂交中有时会表现出很高的同源性。 这使得ｒＲＮＡ在分类研究和系统发育上具有 ＤＮＡ—ＤＮＡ杂交所不可比拟的优越性。一般来说 ＤＮＡ—ＤＮＡ杂交反映种及亚种水平的信息，而 ＤＮＡ—ｒＲＮＡ杂交反映的是属与属以上水平的 信息。 ３ 基于核酸结构的分析 ３．１核酸一级结构的分析 ３．１．１ １６Ｓ ｒＲＮＡ／ｒＤＮＡ基因序列的分析在漫 长的进化中，ｒＲＮＡ的结构有较好的保守性，因此 一些特征核酸序列，成为了属种鉴定的分子基础。 其中位于原核细胞核糖体小亚基上的１６Ｓ ｒＲＮＡ 长约１ ５４０ ｂｐ，结构和碱基排列复杂度适中，较 易于进行序列测定和分析比较，因此广泛被用作 细菌之间种属鉴定的依据 。该技术目前在放 线菌分类中常被用于放线菌种属的初步鉴定，但 是值得注意的是仅根据该指标并不能确定菌株的 种属，必须结合其他的分类指标。 ３．１．２ １６Ｓ～２３Ｓ ｒＲＮＡ转录间区序列的分析 １６Ｓ～２３Ｓ ｒＲＮＡ转录间区序列（１６Ｓ～２３Ｓ ｒＲＮＡ 采取有效的手段，以确保能够扩增出所有的拷贝。 目前在放线菌分类学中该项技术应用于种以下分 类单元的鉴定 。 ３．２ ＲＮＡ二级结构的分析 １９８１年，Ｗｏｅｓｅ等以Ｅ．ｃｏｌｉ的１６Ｓ ｒＲＮＡ基因 为研究对象，初步推断出了１６Ｓ ｒＲＮＡ基因二级 结构模型，揭示其具有比一级结构更大的保守性， 并且具有很多一级结构没有的特征，如茎环结构 等，这些特征有很强的种属特异性。近年来ＲＮＡ 二级结构的研究逐渐为分类学家所关注，已有分 类学家利用１６Ｓ ｒＲＮＡ的二级结构进行种属，甚 至更高分类级别的修正和分析 。陈国忠等也 已将该项技术应用于放线菌分类学研究中 。 但是由于ＲＮＡ二级结构模型仍不是十分完善，该 项指征在放线菌分类学领域还没有得到普遍推 广，相信随着相关研究的不断深入，ＲＮＡ二级结 构会作为一个新的分类指标，成为系统分类的一 个重要补充。 ４ 基于ＤＮＡ指纹图谱的分析 ４．１ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析 ＤＮＡ性片段长度多态性分析（Ｒｅｓｔｒｉｃ— ｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）是上 世纪末兴起的一种ＤＮＡ分析技术。人们将ＰＣＲ 技术与ＲＦＬＰ分析结合，即利用ＰＣＲ技术扩增普 遍存在于菌株中的保守基因区域，再用特异的限 制性内切酶对得到的基因片段进行酶切、电泳和 图谱分析。 目前１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ—ＲＦＬＰ已是细菌分类中 应用最广的快速分群方法，张海涛等曾应用该法 有效地对海绵中放线菌进行了种属分群¨ 。该 法的结果与１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析具有很好的一致 性，且避免了序列测定等步骤，在普通实验室即可 进行。其缺点是ＤＮＡ酶切片段组分往往较复杂， 难以比较遗传学关系较近的菌株。 维普资讯 http://www.cqvip.com ４期 张妍等：放线菌的分子分类 ４．２ ｒｅｐ－ＰＣＲ指纹分析技术 重复片段ＰＣＲ基因指纹分析（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ．ｅｌｅ— ｍｅｎｔ ＰＣＲ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ｒｅｐ－ＰＣＲ）是基 于重复ＤＮＡ片段的分型方法。在细菌染色体上 存在着一些多拷贝、高保守的重复ＤＮＡ序列， ｒｅｐ—ＰＣＲ指纹分析技术使用互补于这些重复序列 的引物，使位于重复序列间的不同基因区域得到 选择性扩增，对ＰＣＲ产物进行电泳图谱分析，即 可实现种及以下水平的分类和快速鉴定。 ｒｅｐ—ＰＣＲ方法简单、快速、灵敏，因此它在遗 传多样性研究及鉴定同源性很近的菌株时是一个 有效的方法。该技术已用于放线菌有关属的分析 并获得了较好结果 。 ４．３ ＲＡＰＤ分析 随机扩增的多型性ＤＮＡ分析（Ｒａｎｄｏｍｌｙ Ａｍ— ｐｌｉｉｆｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＡＰＤ），是用单 个随机寡核苷酸序列引物对ＤＮＡ进行扩增，并对 扩增产物长度的多态性进行分析的方法。在上世 纪９Ｏ年代，Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ用ＲＡＰＤ对链霉菌种群进 行研究，证明在反应条件优化后，该法可用于种以 下水平的研究。 ＲＡＰＤ分析的优点是不需要基因组的任何信 息，可直接由ＲＡＰＤ所提供的基因组ＤＮＡ指纹图 谱对菌株进行分析。利用该方法可以简单快速地 对菌株进行聚类分析，但是反应条件需进行严格 控制，以确保结果的可比性。该项技术的核心是 随机引物序列的设计，Ａｎｚａｉ 引证实引物中即使１ 个碱基的变化也会导致指纹图谱的变化。 ４．４ ＡＦＬＰ指纹分析技术 扩增性片段长度多型性分析（Ａｍｐｌｉｉｆｄｅ Ｆｒａｇ— ｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）技术是近年来 兴起的一种检测ＤＮＡ多态性的方法。该技术采 用一对性内切酶消化ＤＮＡ，产生一系列ＤＮＡ 性内切酶片段，以此为模板，利用选择性引物 扩增，得到ＡＦＬＰ指纹图谱 。Ｖｅｌａｐｐａｎ 等人 曾采用ＡＦＬＰ技术对芽胞杆菌、大肠杆菌等进行 分析，证明其在病原菌的鉴定上很有效。 该方法的适用范围与ＲＦＬＰ、ｒｅｐ—ＰＣＲ、ＲＡＰＤ 和细菌可溶性蛋白质谱相似，且ＡＦＬＰ综合以上 各方法的优点，分辨率仅低于全基因组序列分析， 稳定性强，可提供更为丰富的分类信息，非常适合 指纹图谱的绘制、遗传连锁图的构建及遗传多样 性的研究。但是由于ＡＦＬＰ操作繁琐，加之其检 测基于基因组上酶切位点的变化，制约了其在相 关领域的应用。 ４．５其他的ＤＮＡ指纹图谱技术 其他的ＤＮＡ指纹图谱技术如基于变性梯度 凝胶电泳（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＤＧＧＥ）、温度梯度凝胶电泳（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＴＧＧＥ） 的ＤＮＡ指纹图谱 等。这些技术均具有分辨率高，鉴定迅速，重复性 好等特点，并且可对等长的ＰＣＲ产物进行进一步 的分离，提高了鉴定的准确性，因此在国外已被应 用于微生物分类学研究，但是由于其对ＤＮＡ片段 的长度和电泳条件等有较高的要求，目前在国内 并没有得到广泛的推广和应用。 经过长期的发展，放线菌分类学的研究已经 从表观现象到基因本质逐步深人，分子分类作为 放线菌分类学的一个新兴的分支，正展现出蓬勃 生机。目前，一些已经完善的分子分类方法，如核 酸序列测定，核酸杂交等已成为放线菌分类研究 的基本方法，相信随着理论研究的不断深人，凝胶 电泳技术等相关技术的不断发展，各种分析测试 仪器的不断普及，更多的分子分类方法，如ＲＮＡ 二级结构测定等将在分类学领域发挥更大的作 用。这些新兴的方法与传统的分类方法相结合， 互相交叉，彼此补充，必将促进放线菌分类学的不 断发展，使放线菌分类体系日臻完善。 参考文献： 维普资讯 http://www.cqvip.com ８２ 微生物学杂志 ２７卷 ・写作常识・ 英文摘要 ＧＢ７７１３—８７规定．为了国际交流，科学技术报告、学位论文和学术论文应附有外文（多用英文）摘 要。英文题名以短语为主要形式，尤以名词短语（ｎｏｕｎ ｐｈｒａｓｅ）最常见，即题名基本上由１个或几个名词 加上其前置和（或）后置定语构成。实词首字母大写，虚词小写（也有４个或５个字母以上的虚词首字 母大写）。一般而言，英文摘要应是中文摘要的转译，所以只要简洁、准确地将中文意译出即可，字数通 常以１５０～１８０个词为宜。英文摘要时态的运用也以简练为佳，常用一般现在时、一般过去时，少用现在 完成时、过去完成时，进行时态和其他复合时态基本不用。采用何种语态，既要考虑摘要的特点，又要满 足表达的需要。一篇摘要很短，尽是不要随便混用，更不要在一个句子里混用，应采用更简洁的被动语 态或原形动词开头。 编写时应避免一些常见的错误：①冠词。主要是定冠词ｔｈｅ易被漏用。Ｔｈｅ用于表示整个群体、分 类、时间、地名以外的独一无二的事物、形容词最高级等较易掌握，用于特指时常被漏用。这里有个原 则，即当我们用ｔｈｅ时，听者或读者确知我们所指的是什么；②数词。避免用阿拉伯数字作首词；③单复 数。一些名词单复数形式不易辨认，从而造成谓语形式出错；④尽量使用短句，因为长句容易造成语义 不清；但要避免单调和重复。
