法医学杂志 ２０１３年４月 第２９卷 第２期 ・１０３・ ＳＮＲＰＮ基因ｒｓ２２００３０位点的分型及甲基化亲缘相关性 李辉 ，徐红梅 ，赵贺 ，李备栩 ，周怀谷 ，赵子琴 （１．复旦大学上海医学院法医学系，上海２０００３２；２．法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现 场物证重点实验室，上海２０００８３） 摘 要：目的建立变性梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）技术与焦磷酸测序 技术对小核核糖核蛋白多肽Ｎ（ｓｍａｌ１ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｎ．ＳＮＲＰＮ）基因ｒｓ２２００３０位点 的分型方法。建立应用焦磷酸测序技术分析ＣｐＧ甲基化状态的方法。探讨ｒｓ２２００３０位点用于亲缘等位基 因判定的可行性。 方法应用ＤＧＧＥ技术对９７例上海地区汉族家系血样ｒｓ２２００３０位点进行分型．同时应 用焦磷酸测序技术对其中２５例血液来源的家系样本的ｒｓ２２００３０位点分型，并对两种方法在ＳＮＰ分型结果 上进行比较。通过重亚硫酸盐修饰联合焦磷酸测序技术分析随机２组家系样本ｒｓ２２００３０位点上游ＣｐＧ甲 基化状态，判断甲基化是否有亲缘相关性。 结果经ＤＧＧＥ检测９７例家系血样ｒｓ２２００３０位点分型结果为 Ｃ纯合子２０例，Ｔ纯合子２９例，Ｃ／Ｔ杂合子４８例。经焦磷酸测序检测２５例血液来源的家系样本结果与 ＤＧＧＥ检测结果一致。经重亚硫酸盐修饰联合焦磷酸测序技术分析，２组血液来源的家系子代的ｒｓ２２００３０ 位点上游ＣｐＧ甲基化状态均与母亲较相似。结论相比ＤＧＧＥ技术，焦磷酸测序技术更精确、方便，适合 大样本、高通量ＳＮＰ分型。重亚硫酸盐修饰联合焦磷酸测序技术可以精确分析ＣｐＧ甲基化状态 ｒｓ２２００３０ 位点可用于亲缘等位基因判定 关键词：法医遗传学；多态性，单核苷酸；核糖核蛋白类，小核：甲基化：变性梯度凝胶电泳 中图分类号：ＤＦ７９５．２ 文献标志码：Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９（ｉ．ｉｓｓｎ．１００４—５６１９．２０１３．０２．００６ 文章编号：１００４—５６１９（２０１３）０２—０１０３—０４ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｅｎｔａｌ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＮＲＰＮ Ｇｅｎｅ ｒｓ２２００３０ Ｌｌ Ｈ ．一 Ｘｕ Ｈｏｎｇ－ｍｅｉ１，ＺＨＡ０ Ｙｕｎ１ Ｌｌ Ｂｅｔ一。ｃ ，ｚＨｏＵ Ｈｕａｉ－ｇｕ２，ＺＨＡｏ Ｚｔ—ｑｉｎｉ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３２，Ｃｈｉ— ｎａｇ ２．Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｉｍｅ Ｓｃｅｎｅ ｄｅｒｉｃｅ．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒｔｏｒａｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｅｖｉｄｅｎｅｅ ａｎｄ Ｓｃｉ— ｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００８３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｂｙ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）ａｎｄ ＰＹ— ｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｒｓ２２００３０（ａ ＳＮＰ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｎ，ＳＮＲＰＮ）．Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＣｐＧ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｂｙ ｐｙ— ｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｐｐｌｙｉｎｇ ｒｓ２２００３０ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｅｎｔａｌ ｏｒｉｇｉｎ ａｌｌｅｌｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｒｓ２２００３０ ｏｆ ９７ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ ｂｙ ＤＧＧＥ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｒｓ２２００３０ ｏｆ ２５ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｇｅｎｏ． ｔｙｐｅｄ ｂｙ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ＳＮＰ．Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｎｉｔｅｄ ｂｉｓｕｌｉｔｅ ｆｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＣｐＧ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｒｅｇｉｏｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｓ２２００３０ ｏｆ ｔｗｏ ｒａｎｄｏｍ ｂｌｏｏｄ ｇｅｎｅａｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｗａｓ ｐａｒｅｎｔａｌ ｒｅｌａｔｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｓ２２００３０ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ９７ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＤＧＧＥ ｗｅｒｅ ２０ Ｃ ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ， ２９ Ｔ ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ．ａｎｄ ４８ Ｃ／Ｔ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ．Ｔｗｅｎｔｙ—ｆｉｖｅ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ ｂｙ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｒｅｓｕｌｔ ｗｉｔｈ ＤＧＧＥ．Ｔｈｅ ＣｐＧ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｒｅｇｉｏｎ ｕｐｓ￣ｅａｍ ｒｓ２２００３０ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｌｄ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ｍｏｔｈｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＤＧＧＥ，ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｓ ｍｏｒｅ ａｃｃｕｒａｔｅ， ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ．ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ．Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｎｉｔｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＣｐＧ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ．Ｉｔ ｉｓ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｔｏ ａｐｐｌｙ ｒｓ２２００３０ ｔｏ ｐａｒｅｎｔａｌ ｏｒｉｇｉｎ ａｌｌｅｌｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃｓ；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ；ｍｅｔｈｙ— ｌａｔｉｏｎ；ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ 单核苷酸多态 ［￣（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ． 定性更高，在法医学领域可作为ＳＴＲ基因座的有力 补充手段。印记基因是指亲缘依赖性单等位基因表 ＳＮＰ）在人类基因组中的总数超过３００万ｌ１１．且遗传稳 作者简介：李辉（１９８６～），男，上海人，硕士研究生，主要从事 法医物证学研究；Ｅ—ｍａｉｌ：１０２１１０１００５５＠ｆｕｄａｎ．ｅｄｕ．ａｎ 达，即只有一个父源性或母源性等位基因表达，印记 基因的表达不符合经典的孟德尔遗传定律，其表达与 否取决于其亲代来源 ＤＮＡ甲基化是基因印记的重要 标志．ＤＮＡ甲基化差异的区域被称为差异甲基化区 通信作者：赵子琴，女，教授，主要从事法医病理学及法医临床 学研究：Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｑｚｈａｏ＠ｓｈｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ・１０４・ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．２ 域（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ，ＤＭＲ）。Ｈｕａｎｇ等圆 应用ＰＩＡ法检测Ｈ１９基因上游片段４个ＳＮＰ位点。 成功对父源和母源印记基因进行了判定，表明等位基 ｉｒｔｅ试剂盒（德国ＱＩＡＧＥＮ公司），ＰＣＲ扩增试剂盒（上 海天根生化科技有限公司）。 １．２样本及ＤＮＡ提取 因亲缘差异性ＤＮＡ甲基化联合毗邻的ＳＮＰ位点多 态性在法医亲权鉴定中有良好的应用前景【３１。 ｒｓ２２００３０位点位于小核核糖核蛋白多肽Ｎ基因 （ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｈ０ｎｕｃｌｅ０ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｎ，ＳＮＲＰＮ） 收集９７例上海地区汉族人群家系血样（２５例血 液样本由瑞金医院提供．７２例血痕样本由司法部司 法鉴定科学技术研究所提供），其中有２９个三联体家 系样本和２个五代家系样本。运用ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ 试剂盒提取ＤＮＡ。 上游启动子区域，ｒｓ２２００３０位点上游存在若干ＣｐＧ， 其邻近的ｒｓ２２００２８已被证实可用于亲缘等位基因判 定［４１。本研究先运用ＤＧＧＥ技术对９７例上海地区汉 族家系血样的ｒｓ２２００３０位点进行定性分型，同时运 １．３引物合成 根据ＧｅｎＢａｎｋ序列资料提供的ｒｓ２２００３０位点正 反向序列信息，应用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计一 对ＤＧＧＥ测序引物。由上海生工生物技术公司合成 （表１）。应用ＰｙｒｏＭａｒｋ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．０软 用焦磷酸测序技术对其中的２５例血液来源的家系样 本的ｒｓ２２００３０位点进行定量分型并加以比较，结合 重亚硫酸盐修饰方法通过焦磷酸测序分析三联体家 系样本ｒｓ２２００３０位点上游ＣｐＧ甲基化状态的关联 性，判断ｒｓ２２００３０是否可用于亲缘等位基因的判定。 件设计４对焦磷酸测序引物（１对用于ＳＮＰ分型，３对 用于检测ｒｓ２２００３０上下游ＣｐＧ甲基化状态），由上海 英骏生物技术公司合成（表２）。 表１ ＤＧＧＥ测序引物 引物 正向 反向 ＧＣ—ｃｌａｍｐ １材料与方法 １．１仪器与试剂 ９７００型ＰＣＲ扩增仪（美国ＡＢ公司），ＤＣｏｄｅ通用 序列（５ 一３ ） ＧＣ—ｃｌａｍｐ—ＡＧＴＣＴＧＧＣＧＴＡＴｒｒ ＧＣＡ 兀 ＧＡ ＡＣＡＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＡＡＴＣＣ ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣ 突变检测系统（美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司），紫外凝胶成像仪 （上海复日科技有限公司）。ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ９６ ＩＤ焦磷酸 测序仪、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ试剂盒、ＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌ— ＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣ 表２焦磷酸测序引物 引物 正向（５ 一３ ） 反向（５ — ３ ） 测序（５ — ３ ） ＳＮＰ分型 Ｉ ＩｒｒＣＴＩ ＩＴＧＧＡＡＧＧＡｒｒＩｒｒＣＡＡＧＴＣ ＧＧＣＣＡＡＡＣＡＡＴＣＣＴＡＡＴＩ ＡＣＡＣＴ ＴＩ１ｒｒＣＣＡＡＡＣＣＡＧＣ Ｉｒｒ 第一个ＣｐＧ ＴＧＡＴ１ＴＦＧＧＧＧＧＡＧＡＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴ ＣＣＣＴＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＡＴＡＣＴＡＣＡＴ ＧＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＧ 第二个ＣｐＧ ＧＧＡＴＡＴｒｒｒｒｒＩ ＩＴＧＧＡＡＧＧＡＴＩＴＩＴＡＡＧＴ ＡＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＣＣＴＡＴＡ ＧＧＡＡＧＧＡＴＩＴｒＡＡＧ３ＴＦＧＧ 第三个ＣｐＧ ＧＧＡＴＡ３Ｔ１３３３ＴＩＴＧＧＡＡＧＧＡＴＩ３￣ＡＡＧＴ ＣＴＡＡＴＩＴＡＣＡＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＦ ＡＴＶＦＧＴＡＴｒＧＡＴｒＧＴＧＧＴＦＡＴ １．４ ＰＣＲ扩增 到６０℃，１０ Ｌ ＰＣＲ扩增产物与２ Ｌ ６×溴酚蓝二甲 苯青上样缓冲液混匀后点样．电泳电压１７０Ｖ，电泳时 间２１０ｍｉｎ。电泳结束后，凝胶经ＥＢ染色３０ｍｉｎ后， ＤＧＧＥ的ＰＣＲ反应体系为１０ Ｌ：ＤＮＡ模板４ Ｌ， 正反向引物各０．５ Ｌ，ＰＣＲ反应混合液５ Ｌ。扩增条 件：９５℃５ｍｉｎ；９４ ｏＣ ３０ Ｓ，６０℃３０ Ｓ，７２℃６０ Ｓ，３５个 循环：９５ ｃ（＝５ｍｉｎ 用紫外凝胶成像仪观察结果。 １．６焦磷酸测序技术ＳＮＰ分型 采用焦磷酸测序技术对２５例血液来源的家系样 焦磷酸的ＰＣＲ反应体系为５０ Ｌ：Ｈ２０ ３４．８ ＩｘＬ， 缓冲液１０ Ｌ，ｄＮＴＰ １ Ｌ，Ｐ１ １卜ＬＬ，Ｐ２ １ Ｌ，ＤＮＡ模 板２ Ｌ， 酶０．２ Ｌ。扩增条件：９５℃５ ｍｉｎ；９５℃ ３０ Ｓ，５３℃３０ Ｓ，７２ ｏＣ ６０ Ｓ，３８个循环；７２ ｏＣ ７ｍｉｎ。 本ｒｓ２２００３０位点进行分型，根据ＰｙｒｏＭａｒｋ ＡＱ模式设 计好程序并在试剂仓内加好程序给定剂量的反应酶 底物和ｄＮＴＰ等试剂，并通过ＰｙｒｏＭａｒｋ ＡＱ—ＳＮＰ模式 １．５ ＤＧＧＥ技术ＳＮＰ分型 采用ＤＧＧＥ技术对９７例家系样本ｒｓ２２００３０位 点进行分型，变性梯度凝胶由ｌ０％聚丙烯酰胺『 （丙 烯酰胺）： （双丙烯酰胺）＝３７．５：１］配制而成，变性剂含 量梯度范围３５％～６５％，１００％变性剂包含７ ｍｏｌ／Ｌ尿 素、４０％去离子甲酰胺，１ｘＴＢＥ作为电泳缓冲液加热 读取分析结果。 １．７重亚硫酸盐修饰 随机选择２组血液来源的家系样本用ＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｉｆｔｅ试剂盒进行重亚硫酸盐修饰。反应体系为 １４０ Ｌ（８５ Ｌ亚硫酸盐混合液，３５ Ｌ ＤＮＡ保护缓 冲液，２０ Ｌ ＤＮＡ模板），根据试剂盒说明书完成操作。 ・１０６・ 表３家系样本ｒｓ２２００３０上游甲基化状态 ｆ％） ３讨论 ３．１ ｒｓ２２００３０位点的ＤＧＧＥ技术ＳＮＰ分型 变性梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｅ． ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＤＧＧＥ）技术作为一种经典的电泳ＳＮＰ分 型技术，对于小规模、低通量的ＳＮＰ分型或者突变检 测中具有一定的实用性。ＤＧＧＥ是利用ＤＮＡ片段双 螺旋解链温度（Ｔｍ）的差异进行突变分析。ＤＮＡ片段 在变性梯度凝胶中电泳时，起初双螺旋ＤＮＡ片段以 恒定速率向前迁移，在抵达变性效果相当于其Ｔｍ值 的变性剂浓度点时，双链ＤＮＡ开始部分解链而呈分 支状使其迁移速度极度减缓，几乎处于“停顿”状态。 长度相同的ＤＮＡ片段，即使仅存在单个碱基改变，也 将影响邻近碱基间的相互作用，导致Ｔｍ值改变，从而 使ＤＮＡ片段在相同电泳时间内因不同位移而得以分 离ｌ ５ｌ。赵赞等［６１运用ＤＧＧＥ技术与ＴａｑＭａｎ探针技术对 １００例上海汉族人群ｒｓ２２００３０位点进行分型得出群 体遗传学数据，证明该ＳＮＰ位点满足法医亲权鉴定 和个人识别的需要。本研究运用ＤＧＧＥ技术对９７例家 系样本进行ｒｓ２２００３０位点分型，检测出１条电泳谱带 的为纯合子（靠下的为Ｃ纯合子，靠上的为Ｔ纯合子）， ４条电泳谱带的为杂合子（２条为同源双链。２条为异 源双链）。同时本研究在引物的５ 端加入一段４０ｂｐ 的ＧＣ—ｃｌａｍｐ序列可立刻提高其对单碱基突变的检 测效率，与Ｓｈｅｆｉｆｅｌｄ等ｌ７】得出相同结论。 ３．２焦磷酸测序技术ＳＮＰ分型的优势 焦磷酸测序（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）是一种实用的短序 列实时检测技术，能够准确定量检测出单个ＳＮＰ位 点的多态性Ｉｓ］。在ＳＮＰ分型上，ＤＧＧＥ技术存在操作 过程繁琐、通量低、一次仅能检测十多个样本、变性梯 度凝胶配制难度大等问题，而焦磷酸测序技术一次测 序只需设计一对扩增引物和一个测序引物即可．不需 要制胶、毛细管、荧光染料和同位素，易于构建标准化 的操作流程进行大样本群体ＳＮＰ分型，灵敏度高、准 确性高、精确性好。与传统的直接测序法比较，焦磷酸 测序技术可以读出引物结合以后的临近碱基．更有助 于对小片段的精确定性，而传统的直接测序法在引物 结合位置后的２０个碱基左右通常不可读。本研究针 对２５例血液来源的家系样本进行焦磷酸测序．Ｃ纯 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．２ 合子结果为Ｃ：１００％，Ｔ：０％；Ｔ纯合子结果为Ｃ：０％， Ｔ：１００％：Ｃ／Ｔ杂合子结果为Ｃ和Ｔ百分比各占一半 左右（Ｃ：５８％，Ｔ：４２％）。结果与ＤＧＧＥ技术检测结果 一致，但相比ＤＧＧＥ技术，进行焦磷酸测序操作过程 简单直接，无需配制变性梯度凝胶，无需反复摸索电 泳条件，并且在结果观察上，相比观察ＤＧＧＥ电泳谱 带可能出现伪带的情况。焦磷酸测序结果更为直观。 ３．３焦磷酸测序技术分析ＣｐＧ甲基化状态 应用焦磷酸测序对ＣｐＧ甲基化状态进行分析， 结合重亚硫酸盐修饰方法，用重亚硫酸盐将未甲基化 的胞嘧啶（Ｃ）修饰为尿嘧啶（Ｕ），甲基化的胞嘧啶保 持不变，经过ＰＣＲ扩增后，尿嘧啶（Ｕ）将变成胸腺嘧 啶（Ｔ），由此单个ＣｐＧ甲基化状态的分析就转化为普 通ＳＮＰ位点的Ｃ／Ｔ单碱基多态性分析．其中等位基 因Ｃ的频率即为基因甲基化的程度，能够准确定量 分析出待测基因的ＣｐＧ甲基化状态［９１。本研究对经过 重亚硫酸盐修饰的２组家系样本进行ｒｓ２２００３０上游 ＣｐＧ甲基化状态进行分析，单个ＣｐＧ等位基因Ｃ的 频率即为该ＣｐＧ上胞嘧啶甲基化程度，如家系１母 亲样本３个ＣｐＧ的Ｃ等位基因频率分别为６６％、６４％、 ５５％，表示这３个ＣｐＧ胞嘧啶的甲基化程度分别为 ６６％、６４％、５５％。 ３．４ ｒｓ２２００３０位点上游ＣｐＧ甲基化亲缘相关性 通常亲子鉴定中假设父不具备生父基因，即可排 除亲子关系，但在某些情况下如母亲和孩子为相同基 因型的杂合子时，则生父、生母基因无法确定。联合分 析毗邻印记基因座的亲缘特异性甲基化标记和多态 性遗传标记，可解决单亲家系亲代与子代为相同基因 型的杂合子时，生父、生母基因无法确定的问题 Ｉ 人类基因组中，ＣｐＧ二核苷酸在基因启动子区和第一 外显子区域等一些特定区域常成簇出现，形成ＣｐＧ富 集现象，称为ＣｐＧ岛（ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ），以往对亲缘差异 性甲基化的研究主要集中在ＣｐＧ岛。ｒｓ２２００３０位于 ＳＮＲＰⅣ基因上游启动子区域，Ｎａｋａｙａｓｈｉｋｉ等…］研究 发现５个印记基因（Ｈｌ９、ＨＹＭＡＩ、ＭＥＳＴ、ＳＮＰＲＮ、ＰＥＧ） 内有７个以上ＳＮＰ可用于亲缘等位基因判定，其中 的ｒｓ２２００２８与ｒｓ２２００３０毗邻，ｒｓ２２００３０位点虽然不 在ＣｐＧ岛上，但ｒｓ２２００３０与ｒｓ２２００２８之间有３个散 在的ＣｐＧ。本研究应用焦磷酸测序技术对经过重亚硫 酸盐修饰过的２组三联体家系样本ｒｓ２２００３０上游 ＣｐＧ甲基化状态进行检测，分析其亲缘相关性，子代 ３个ＣｐＧ的甲基化程度与母亲３个ＣｐＧ的甲基化程 度接近（表３），表明子代３个ＣｐＧ的甲基化来源于母 亲。从而说明了在启动子区域内ＣｐＧ岛邻近的散在 ＣｐＧ也可能存在甲基化亲缘相关性，（下转第１１５页） 法医学杂志 ２０１３年４月 第２９卷 第２期 ・ｌｌ５・ ａｄｄｕｃｔｓ ｏｆ １，３－ｂｕｔａｄｉｅｎｅ，ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ０ｆ １．３－ｂｕｔａｄｉｅｎｅ ａｎｄ ｂｕｔａｄｉｅｎｅ ｅｐｏｘｉｄｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ［Ｊ］．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０００，２ １（１）：１ ０７一ｌ１ １． ［６］ Ｓａｔｈｉａｋｕｍａｒ Ｎ，Ｄｅｌｚｅｌｌ Ｅ，Ｈｏｖｉｎｇａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｍｏ￣ａｌ— ｉｔｙ ｆｒｏｍ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃａｎｓｅｓ ｏｆ ｄｅａｔｈ ａｍｏｎｇ ｓｙｎ— １，３－ｂｕｔａｄｉｅｎｅ ｂｙ ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１９９４， １５ｆ８）：１４７９—１４８６． Ｐｅｔｅｒｓ ＦＴ．Ｄｒｕｍｍｅｒ ＯＨ．Ｍｕｓｓｈｏｆｆ Ｆ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｔｉｃ ｒｕｂｂｅｒ ｗｏｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｏｃｃｕｐ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｅｄ，１９９８， ５５（４）：２３０—２３５． ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ ｌｎｔ，２００７，１６５（２－３）：２１６— ２２４． ［７】 Ｃｈｅｎｇ Ｈ，Ｓａｔｈｉａｋｕｍａｒ Ｎ，Ｇｒａｆｔ Ｊ，ｅｔ ａ１．１，３－Ｂｕｔａｄｉ— ｅｎｅ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｍｏｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｒｕｂｂｅｒ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｗｏｒｋｅｒｓ：ｅｘｐｏｓｕｒｅ—ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｂｉ— ｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ。２００７，１６６（１—３）：１５．２４． ｋｋｅｍａ Ｊ，ｄｅ Ｂｏｎｔ ＪＡ，Ｐｏｏｌｍａｎ Ｂ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ［１２］ Ｓｉｃｙｃｌｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ ｗｉｔｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，ｌ ９９４．２６９（１１ ：８０２２—８０２８． Ｗｅｂｅｒ ＦＪ．Ｉｓｋｅｎ Ｓ．ｄｅ Ｂｏｎｔ ＪＡ．Ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒｉｚａ— ［１３］ ｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｓ ａ ｄｅｆｅｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｐｓｅｕ— ｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｏ ｔｏｘｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ［８］ Ｂｒｕｎｎｅｍａｎｎ ＫＤ，Ｋａｇａｎ ＭＲ，Ｃｏｘ ＪＥ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙ－ ｓｉｓ Ｏｆ １．３－ｂｕｔａｄｉｅｎｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇａｓ・ｐｈａｓｅ ｃｏｍ－ ｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ ａｎｄ ｓｉｄｅｓｔｒｅａｍ ｓｍｏｋｅ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ・ｍａｓｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］＿ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｌ９９０，ｌ１（１０）：１８６３．１８６８． ［９］Ｆｏｗｌｅｓ Ｊ，Ｄｙｂｉｎｇ Ｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，１４０（Ｐｔ ８）：２０１３－２０１７． Ｃｈｒｉｓｔｉｅ ＷＷ．Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ［１４］ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｉｎ：Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｌｉｐｉｄｓ［Ｍ】． Ｏｌｉｙ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，１９９８，ｃｈａｐｔｅｒ ５，ｓｅｃｔｉｏｎ Ｃ． ｆＲｅｃｅｉｖｅｄ ｄａｔｅ：２０１２一ｌ１．０７） （Ｅｄｉｔｏｒ：ＬＩＡＮＧ Ｌｕ） ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ［Ｊ］．Ｔｏｂ Ｃｏｎｔｒｏｌ，２００３，１２（４）：４２４－４３０． ［１ ０］Ｈｉｍｍｅｌｓｔｅｉｎ Ｍｗ，Ｔｕｒｎｅｒ ＭＪ，Ａｓｇｈａｒｉａｎ Ｂ，ｅｔ ． （上接第１０６页）结合毗邻的ＳＮＰ位点，有用于亲缘等 位基因判定的可行性 参考文献： ［１］Ｓｈｅｒｒｙ ＳＴ，Ｗａｒｄ ＭＨ，Ｋｈｏｌｏｄｏｖ Ｍ，ｅｔ ａ１．ｄｂＳＮＰ： ｔｈｅ ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００１，２９（１）：３０８—３１１． ｉｅｌｄ ＶＣ，Ｃｏｘ ＤＲ，Ｌｅｒｍａｎ ＬＳ，ｅｔ ．Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ［７］ Ｓｈｅｆｆｏｆ ａ ４０一ｂａｓｅ－ｐａｉｒ Ｇ＋Ｃ—ｒｉｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＧＣ—ｃｌａｍｐ）ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｂａｓｅ ｃｈａｎｇｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９８９，８６（１）： ２３２—２３６． ｎｃｋｍａｎｎ Ａ，Ｔｏｌｉａｔ ＭＲ，ｅｔ ［８】 Ｕｈｌｍａｎｎ Ｋ，Ｂｒｉ． ［２］Ｈｕａｎｇ Ｄ，Ｌｉｎ Ｘ，Ｃｈｅｎ Ｈ，ｅｔ ．Ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ａｌｌｅｌｅ （ＰＩＡ）ｔｙｐｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌ—ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｒｅｇｉｏｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｈ１９ ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ Ｉｎｔ Ｇｅｎｅｔ，２００８，２（４）：２８６．２９１． ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００２，２３（２４）：４０７２－４０７９． ［９］ Ａｈｍａｄｉａｎ Ａ，Ｅｈｎ Ｍ，Ｈｏｂｅｒ Ｓ．Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｈｉｓ— ［３］赵书民，李成涛．ＤＮＡ甲基化在法医学中的应用前景 ｔｏｒｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ａｎｄ ｆｒｕｔｕｒｅ【Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ， ２００６，３６３（１－２）：８３—９４． 及其检测方法新进展［Ｊ］．法医学杂志，２００９，２５（４）：２９０— ２９５． ａ１．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ［１０］ Ｚｈａｏ Ｇ，Ｙａｎｇ Ｑ，Ｈｕａｎｇ Ｄ，ｅｔａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｅｎｔ－－ｏｆ－ｏｒｉｇｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａ—－ ［４］ Ｎａｋａｙａｓｈｉｋｉ Ｎ，Ｔａｋａｍｉｙａ Ｍ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ｏ１． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ａｒｏｕｎｄ ｐａｒｅｎｔ— ｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ Ｉｎｔ， ２００５，１５４（２－３）：１２２．１２７． Ｎａｋａｙａｓｈｉｋｉ Ｎ，Ｔａｋａｍｉｙａ Ｍ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａ１． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｐａｒｅｎｔａｌ ａｌｌｅｌｅ ｉｎ ｏｆ－ｏｒｉｇｉｎ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ＳＮＰｓ ｉｎ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］． Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ Ｉｎｔ Ｇｅｎｅｔ，２００９，３（４）：２２７—２３２． ［５］黄代新，王功跃．变性梯度凝胶电泳及其在法医学中 的应用【Ｊ］．法律与医学杂志，２００５，１２（２）：１４５—１４８． ［６］赵赘，徐红梅，赵子琴．ＤＧＧＥ技术检测小核核糖核蛋 白多肽Ｎ基因ｒｓ２２００３０位点的多态性［Ｊ］．法医学杂志． ２０１１，２７（３）：１８６—１８８． ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ： Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ，２００８，１（１）：５７２—５７３． ｛收稿日期：２０１３一Ｏ１—２１） （本文编辑：李成涛）